孫曉萌 李瀟 朱笳悅 韓朔 楊鑫偉 許利平

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一,其高發(fā)病率和高致殘率嚴(yán)重影響人們的生活和質(zhì)量,尋找治療的有效藥物,是目前一直研究和觀注的重點(diǎn)。雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的特有膠質(zhì)細(xì)胞,在神經(jīng)損傷與修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。高糖環(huán)境下SCs的正常代謝過(guò)程被破壞,從而使神經(jīng)毒性的終產(chǎn)物積累,影響神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。已有研究表明芍藥苷(paeoniflorin,PF)可以促進(jìn)高糖培養(yǎng)的SCs的增殖,對(duì)抗高糖環(huán)境對(duì)SCs增殖的抑制作用[3],并有可能是潛在的神經(jīng)生長(zhǎng)促進(jìn)因子[4]。課題組近期研究發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondriaassociated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)參與了SCs的代謝過(guò)程,糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制與MAMs密切相關(guān),本實(shí)驗(yàn)以MAMs為切入點(diǎn),圍繞PF調(diào)控MAMs膜上功能蛋白和鈣離子參與SCs凋亡,試圖闡明PF對(duì)高糖環(huán)境下SCs凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和藥品

雪旺細(xì)胞株RSC96,為中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株。

芍藥苷,購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)：110736-201035

1.2 主要試劑

葡萄糖(G8150,Sigma)；無(wú)水甲醇(20180226,北京化工廠)；PBS(P1020-500,Solarbio)；ER-tracker(P1041,Beyotime)；Mito-tracker(P1048,Beyotime)；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(R0010-100,Solarbio)；anti-Mitofusin2抗體(ab124773,abcam)；DMEM(PM150210,Procell)；胎牛血清(16000-044,Gibco),DMSO(Sigma,D2650-100ml)。

1.3 主要儀器

手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Millpore,AH01YOUQ)；低溫離心機(jī)(Sigma,3K15)；超速離心機(jī)(BECKMAN,L-80XP)；高級(jí)研究型顯微鏡(Nikon,ECLIPSE 80i)；定制型流式細(xì)胞儀(Becton,Dickinson and Company,BD LSRFortessa)；激光共聚焦顯微鏡(Leica,TCS SP8)；透射電子顯微鏡(Hitachi,HD7700)；基礎(chǔ)電泳儀電源(PowerPacTM),電泳槽(Mini-PROTEAN?Tetra),轉(zhuǎn)印槽(Trans-Blot?),均來(lái)自Bio-Rad。

1.4 細(xì)胞處理、分組與蛋白樣品提取

1.4.1 RSC96細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 從-80℃低溫冰箱中取出凍存細(xì)胞后迅速放入37℃水浴鍋內(nèi)溫浴1分鐘,將細(xì)胞懸液加入預(yù)先加過(guò)培養(yǎng)基的離心管內(nèi)1000 r/min離心5分鐘,棄上清,使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,接種于新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),接近長(zhǎng)滿時(shí),用0.25%胰酶消化細(xì)胞1 mL,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓并有部分脫落后,加入含血清培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞,使其逐漸脫落并制成細(xì)胞懸液,接種于新的培養(yǎng)皿中。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 取5個(gè)培養(yǎng)瓶分別標(biāo)記為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,PF低、中、高劑量組。取RSC96細(xì)胞,胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,采用手持細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù),每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入5×106個(gè)細(xì)胞,貼壁培養(yǎng)12小時(shí)以上。配置空白對(duì)照組(25 mM glucose DMEM+10%FBS),模型對(duì)照組(150 mM glucose DMEM+10%FBS),PF低劑量組(150 mM glucose DMEM+10%FBS+1 μM PF),PF中劑量組(150 mM glucose DMEM+10%FBS+10 μM PF),PF高劑量組(150 mM glucose DMEM+10%FBS+100 μM PF)。取出貼壁的RSC96細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)基,加入以上配置好的藥品,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)與48小時(shí)。

1.4.3 MAMs蛋白提取 采用胰酶將培養(yǎng)24小時(shí)與48小時(shí)的細(xì)胞消化成懸液后,轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中。采用4℃低溫冷凍離心機(jī)800 g,離心10分鐘,取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；更改離心條件為9000 g,離心10分鐘,棄上清,用PBS將沉淀吹散；更改離心條件為10000 g,離心10分鐘,重復(fù)2次后取沉淀；采用超速離心機(jī)設(shè)置為95000 g,離心30分鐘。吸出大約距管底約1 cm處的漂浮于溶液中的環(huán)狀絮狀白色固體于離心管中,更改離心條件為6300 g,離心10分鐘后取沉淀。再次采用超速離心法,更改條件為100000 g,離心30分鐘,沉淀部分為MAMs蛋白。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 激光共聚焦觀察MAMs形態(tài)與數(shù)量 取LAB-TekTMII腔室蓋玻片8孔板,分別標(biāo)記為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,PF低劑量組,PF中劑量組和PF高劑量組。取RSC96細(xì)胞鋪板后貼壁生長(zhǎng)12小時(shí)后,吸棄培養(yǎng)基加藥,同1.4.2。吸棄培養(yǎng)液,每孔加入300 μL Mito-tracker工作液,于37℃孵育50分鐘。PBS清洗3次后,加入ER-tracker工作液于37℃孵育30分鐘。去除工作液,加入新鮮配置的細(xì)胞培養(yǎng)液。采用STED超高分辨率共聚焦顯微鏡觀察活細(xì)胞。每組4個(gè)樣本,每個(gè)樣本隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域,采用積分光密度法計(jì)數(shù),將6個(gè)區(qū)域的均值作為每個(gè)樣本的光密度。對(duì)Merge后線粒體標(biāo)記蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白重疊的部分,以積分光密度衡量含量,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5.2 Western blot法檢測(cè)線粒體融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)表達(dá) 將含DTT的上樣緩沖液與MAMs蛋白樣品1∶3體積混合,于沸水變性。冷卻后分裝存放于-20℃待測(cè)。在10%SDS-PAGE凝膠孔中加入等量蛋白進(jìn)行電泳分離,并使用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫孵育2小時(shí)后采用MFN2抗體(1∶2000)4℃孵育過(guò)夜,TBST浸洗后,繼續(xù)室溫孵育山羊抗兔抗體1小時(shí),使用TBST浸洗,加入超敏發(fā)光液后使用發(fā)光顯影儀曝光。應(yīng)用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析獲得灰度值,以β-actin為內(nèi)參,每組重復(fù)4次,計(jì)算相對(duì)蛋白含量。

1.5.3 Elisa法檢測(cè)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)蛋白表達(dá) 采用MAMs蛋白,取PERK ELISA試劑盒,于室溫(20～25℃)放置30分鐘。取出酶標(biāo)板,按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序依次分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。在空白微孔中加入100 μL樣品,再加入10 μL平衡液。在各孔加入50 μL的酶標(biāo)記溶液,37℃孵育1小時(shí)。充分清洗酶標(biāo)板后,用吸水紙徹底拍干。各孔依次加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL。于20～25℃下避光反應(yīng)10分鐘后,加入50 μL終止液以終止反應(yīng)。將微孔板置于450 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀下進(jìn)行讀數(shù)(吸光度值即為OD值)。每組重復(fù)4次,以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品的數(shù)據(jù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得蛋白含量。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞Ca2+水平 將細(xì)胞分為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,PF低、中、高劑量組；分別鋪板加藥后,孵育24小時(shí)和48小時(shí)(同1.4.2)。采用無(wú)EDTA胰酶消化細(xì)胞,并收集于2 mL離心管中。加入1 mL培養(yǎng)基,1000 r/min離心5分鐘后,吸棄培養(yǎng)基。加入500 μL的Fluo-AM3(0.5 μm),將細(xì)胞吹打均勻,37℃孵育30分鐘后,1000 r/min離心5分鐘。吸棄250 μL上清液,繼續(xù)加入250 μL的PBS,37℃孵育30分鐘。1000 r/min離心5分鐘后,吸棄上清液。加入500 μL的PBS,將細(xì)胞吹打均勻后,使用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組樣本比較采用單因素方差分析,方差齊性條件下,選擇LSD分析,方差不齊性條件下,選擇Tambane's T2分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs的形態(tài)與含量

SCs呈梭形,綠色部分為線粒體,由Mito-tracker標(biāo)記；紅色部分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng),由ER-tracker標(biāo)記；重疊部分為MAMs。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示干預(yù)24小時(shí)和48小時(shí)后：與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組MAMs含量顯著降低(P＜0.01),SCs梭形不明顯,形態(tài)變小不規(guī)則；與模型對(duì)照組比較,PF各組MAMs含量顯著增加(P＜0.01),SCs形態(tài)得到改善,趨于棱形,見圖1、圖2 與表1。

圖1 共聚焦觀察24小時(shí)高糖環(huán)境下的MAMs形態(tài)(×630)

圖2 共聚焦觀察48小時(shí)高糖環(huán)境下的MAMs形態(tài)(×630)

表1 高糖環(huán)境下SCs中MAMs的共聚焦積分光密度(n=4,±s)

表1 高糖環(huán)境下SCs中MAMs的共聚焦積分光密度(n=4,±s)

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較,bP＜0.01。

1.00±0.12 1.00±0.09模型對(duì)照組 0.49±0.17a 0.52±0.12a PF 低劑量組 0.87±0.13b 0.89±0.19b PF 中劑量組 0.65±0.14b 0.78±0.10b PF 高劑量組 0.74±0.20b 0.69±0.11小時(shí)空白對(duì)照組組別 24小時(shí) 48 b

2.2 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs中Mfn2表達(dá)

Mfn2低表達(dá)影響細(xì)胞代謝。RSC96細(xì)胞干預(yù)24小時(shí)和48小時(shí)后：與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組Mfn2表達(dá)顯著降低(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較,PF各劑量組Mfn2表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見表2。

表2 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs中Mfn2的影響(n=4,±s)

表2 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs中Mfn2的影響(n=4,±s)

注：與空白對(duì)照組比較aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較bP＜0.01。

組別 24小時(shí) 48 1.00±0.13 1.00±0.10模型對(duì)照組 0.50±0.10a 0.59±0.10a PF 低劑量組 0.85±0.12b 0.82±0.16b PF 中劑量組 0.72±0.20b 0.80±0.11b PF 高劑量組 0.64±0.17b 0.70±0.10小時(shí)空白對(duì)照組b

2.3 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs中PERK表達(dá)

PERK的過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。干預(yù)RSC96細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)：與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組PERK表達(dá)明顯升高(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較,芍藥苷低劑量組和芍藥苷中劑量組PERK表達(dá)顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),芍藥苷高劑量組表達(dá)也有明顯下降(P＜0.05),見表3。

表3 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs中PERK的影響(n=4,±s)

表3 PF對(duì)高糖環(huán)境下MAMs中PERK的影響(n=4,±s)

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較bP＜0.05,cP＜0.01。

組別 24小時(shí) 48 1.00±0.02 1.00±0.02模型對(duì)照組 1.44±0.10a 1.55±0.11a PF 低劑量組 1.18±0.09c 1.01±0.08c PF 中劑量組 1.25±0.09c 1.16±0.15c PF 高劑量組 1.30±0.12b 1.39±0.15小時(shí)空白對(duì)照組b

2.4 芍藥苷對(duì)高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞Ca2+水平

Ca2+水平的上升是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素之一。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組Ca2+水平顯著升高(24小時(shí)升高3.63倍,48小時(shí)升高2.05倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較,芍藥苷各劑量組均能夠顯著降低Ca2+水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；提示PF能夠緩解高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞Ca2+水平,見表4。

表4 PF對(duì)高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞Ca2+的影響(n=4,±s)

表4 PF對(duì)高糖環(huán)境下RSC96細(xì)胞Ca2+的影響(n=4,±s)

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.01；與模型對(duì)照組比較bP＜0.01。

1.00±0.10 1.00±0.12模型對(duì)照組 3.63±0.12a 2.05±0.10a PF低劑量組 1.21±0.08b 1.06±0.09b PF中劑量組 1.61±0.09b 1.09±0.09b PF高劑量組 1.55±0.12b 1.15±0.08小時(shí)空白對(duì)照組組別 24小時(shí) 48 b

3 討論

高血糖誘導(dǎo)的SCs病變是糖尿病周圍神經(jīng)病變的主要發(fā)病機(jī)制之一,SCs在神經(jīng)損傷的修復(fù)中起著重要作用。氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激均能夠引起SCs凋亡。高糖環(huán)境下未折疊蛋白的過(guò)度堆積引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5],激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK,繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡[6-7]。

近年研究發(fā)現(xiàn)[8],線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間存在由特定蛋白質(zhì)經(jīng)由物理連接形成的亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu),即MAMs。MAMs[9-10]經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互調(diào)控,其機(jī)制與MAMs上多種功能蛋白和Ca2+信號(hào)密切相關(guān)。Mfn2作為線粒體外膜上一種跨膜GTP酶,介導(dǎo)線粒體融合,參與細(xì)胞能量代謝、增殖及凋亡等。研究還發(fā)現(xiàn)[11-12]Mfn2不僅參與調(diào)控線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu),還與細(xì)胞代謝、增殖、凋亡密切相關(guān)。Mfn2能夠引起下調(diào)Ca2+內(nèi)流,緩解細(xì)胞內(nèi)鈣超載從而緩解細(xì)胞凋亡。PERK[13]是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種跨膜蛋白,PERK信號(hào)通路的激活在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期可以通過(guò)抑制蛋白的合成發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用,促進(jìn)細(xì)胞生存。但隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),PERK則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。SCs的凋亡影響周圍神經(jīng)功能,進(jìn)一步影響糖尿病周圍神經(jīng)病變。已有研究[14]表明,Mfn2是PERK的上游調(diào)節(jié)劑,并在物理上與PERK相互作用,Mfn2損傷的細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下表現(xiàn)出PERK的持續(xù)激活。早期PERK能夠使線粒體鈣正常化,但后期則誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)流進(jìn)入線粒體的Ca2+增加,促進(jìn)鈣超載,引發(fā)細(xì)胞凋亡。

赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.或川赤芍P.vertchiiLynch的根,在糖尿病周圍神經(jīng)病變的辨證論治中,結(jié)合糖尿病“陰虛為本,燥熱為標(biāo)”的特點(diǎn),常配伍在復(fù)方中[15-16]用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變。課題組前期研究[17]也發(fā)現(xiàn),PF通過(guò)Nrf/ARE途徑減輕線粒體氧化應(yīng)激,降低SCs中氧自由基的含量,從而減輕SCs凋亡,保護(hù)周圍神經(jīng)而改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示高糖環(huán)境下SCsCa2+明顯增多,影響MAMs的形態(tài)和含量,引起細(xì)胞凋亡。結(jié)果還顯示Mfn2表達(dá)下降,影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)異常；PERK表達(dá)的增加,也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Mfn2表達(dá)下降同時(shí)Ca2+增加,PERK表達(dá)也增加的現(xiàn)象證明Mfn2能夠下調(diào)Ca2+,且能夠下調(diào)PERK的表達(dá)。當(dāng)用PF干預(yù)高糖環(huán)境的SCs后,影響MAMs的PERK表達(dá)量,48小時(shí)較24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的差異性更大,說(shuō)明隨著時(shí)間的增加,PF抑制PERK的表達(dá)更加明顯,同時(shí)Ca2+水平下降更顯著,具有一定的時(shí)效關(guān)系。PF干預(yù)后,Mfn2表達(dá)顯著提升的同時(shí)表現(xiàn)為Ca2+水平顯著下降,細(xì)胞凋亡緩解,MAMs的含量提升,PERK的表達(dá)降低,接近正常水平,表明PF通過(guò)上調(diào)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上 Mfn2的表達(dá),而Mfn2能夠下調(diào)PERK的表達(dá),進(jìn)而緩解鈣超載,從而減輕SCs的凋亡,緩解糖尿病周圍神經(jīng)病變。

綜之,PF能夠改善高糖環(huán)境下SCs的MAMs的結(jié)構(gòu)含量和功能蛋白,改善SCs形態(tài),減輕SCs凋亡,有利于改善糖尿病周圍神經(jīng)病變。這與其能夠上調(diào)Mfn2的表達(dá),抑制PERK表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,減輕鈣超載有關(guān)。