馬紅梅 唐超英 張漢花 皮子瑤 余中華

摘?要：為探究固定化乳酸菌對海水中不同因素的耐受性，采用涂布分離計數(shù)法測定海水中不同pH值、NaCl濃度、Pb2+濃度、葡萄糖濃度對固定化乳酸菌生長的影響。結(jié)果表明：海水pH值為6.0，德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌三種乳酸菌在海水中的活菌率分別為98.0%、117.6%、111.4%;在海水中添加NaCl和醋酸鉛溶液均抑制乳酸菌的生長，但屎腸球菌的耐鹽性與耐重金屬鉛的能力均比德式乳桿菌和嗜熱鏈球菌強(qiáng);乳酸菌生長的最適葡萄糖濃度為20%，過量葡萄糖會抑制其生長。綜合比較三種乳酸菌在海水中的生長耐受性，得出屎腸球菌對海水中的pH值、NaCl濃度、Pb2+濃度及葡萄糖變量的耐受性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：固定化乳酸菌;海水;耐受性;屎腸球菌

隨著海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，海水污染越來越嚴(yán)重[1]。因此，必須加強(qiáng)對海水污染的治理。固定化微生物技術(shù)在水處理領(lǐng)域已經(jīng)成為污染治理的研究熱點。韓斌通過比較交聯(lián)法、吸附法及包埋法固定化，得出包埋法的整體性能最好，很好地保留了微生物細(xì)胞的生物活性和催化能力，且包埋的過程操作相對簡單、應(yīng)用靈活[2]，在包埋法中利用海藻酸鈉包埋法是最經(jīng)濟(jì)實惠且有效的方法之一[3]。張強(qiáng)在海藻酸鈉包埋乳酸菌及活性分析實驗中得出，在4%的CaCl2濃度時，包埋率最高，活菌數(shù)最多[4]。

乳酸菌是人及動物腸道中的益生菌，因其獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生物特性使其在食品等領(lǐng)域中得到了很好的應(yīng)用。近幾年有研究人員發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠吸附食品、土壤及淡水中的重金屬[5]，但對乳酸菌在海水中的耐受性研究極少。本課題選用三種固定化乳酸菌，探究海水對固定化乳酸菌細(xì)胞生長的影響，為研究利用固定化乳酸菌處理海水污染問題提供參考。

1?材料與方法

1.1?主要試劑

供試菌株德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、屎腸球菌（Enterococcus Faecium），均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。試劑：氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙酸鉛、葡萄糖、檸檬酸三鈉等為分析純;LB培養(yǎng)基為化學(xué)純。

1.2?實驗方法

1.2.1?乳酸菌的固定化

按照海藻酸鈉濃度為2.0%、CaCl2濃度為2.5%、菌液添加量為20 mL（菌液添加量與無菌水比值為1∶1）的條件制備三種乳酸菌固定化小球。

1.2.2?海水對固定化乳酸菌生長的影響

將固定化后的乳酸菌小球分別投入裝有無菌海水的試管中，以自然海水為對照，分別將海水pH值調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0;海水中加入NaCl，使其濃度分別達(dá)到1%、2%、4%、6%、8%;海水中加入乙酸鉛，使其濃度分別達(dá)到50、100、150、200、250 mg/L;海水中加入葡萄糖，使其濃度分別達(dá)到5%、10%、20%、40%、60%。每個處理各取10 mL配制的液體加入試管中，在每支試管中再分別加入0.5 g固定化后的乳酸菌小球，置轉(zhuǎn)速為150 r/min ，溫度為37.5℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h，收集固定化小球，用無菌水反復(fù)沖洗3～5次，再用檸檬酸三鈉溶膠處理后，取液至LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布平板計數(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?pH值對乳酸菌生長的影響

海水中不同pH值對三種乳酸菌生長的影響見表1。

由表1可知，pH在設(shè)定范圍內(nèi)對德氏乳桿菌的活性影響較大，不同處理組的菌落數(shù)差異明顯，但對嗜熱鏈球菌和屎腸球菌的活性影響較小，處理組間的差異不明顯。三種固定化乳酸菌在pH 4.0～8.0海水中均能生長。當(dāng)海水pH值為6.0時，三種乳酸菌活性均最高，其中屎腸球菌的活菌數(shù)達(dá)到5.85×1010cfu/mL。與對照相比，德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌三種乳酸菌在海水中的活菌率分別為98.0%、117.6%、111.4%;當(dāng)嗜熱鏈球菌在pH 5.0～7.0及屎腸球菌在pH 5.0～8.0之間，兩種乳酸菌的活性均高于對照組，說明在該pH值范圍內(nèi)的海水更適合于嗜熱鏈球菌和屎腸球菌的生長，當(dāng)pH值為8.0時，德氏乳桿菌與嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)均比對照低，而屎腸球菌的活菌數(shù)比對照要高，其活菌率為107.6%，說明屎腸球菌比其他兩種乳酸菌的耐堿性要好。

2.2?NaCl濃度對三種乳酸菌生長的影響

海水中添加不同濃度的NaCl溶液對三種乳酸菌生長的影響見表2。

由表2可知，當(dāng)海水中NaCl溶液濃度大于等于6%時，對三種乳酸菌的活性影響有顯著性差異，三種乳酸菌的活性均隨著濃度的下降而下降。德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌在NaCl濃度為1%～4%時活菌率分別能達(dá)80%以上，在NaCl濃度高于6%之后，德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長明顯受到抑制，活菌率均不到40%。隨著NaCl濃度增加，屎腸球菌的活性逐漸下降，但活性下降不明顯，當(dāng)海水中NaCl溶液濃度為8.0%時，三種固定化乳酸菌活性均受到明顯的抑制，但對屎腸球菌的抑制作用最小，其活性仍能達(dá)到87.6%，可見屎腸球菌耐鹽性明顯比德式乳桿菌和嗜熱鏈球菌高。

2.3?鉛離子濃度對三種乳酸菌生長的影響

海水中不同濃度的鉛離子溶液對三種乳酸菌生長的影響見表3。

由表3可知，隨著海水中重金屬Pb2+濃度的增加，三種乳酸菌的活性不斷下降。不同濃度Pb2+處理組間差異顯著，當(dāng)Pb2+濃度≥150mg/L時，三種乳酸菌不同處理間菌的活性差異極顯著。當(dāng)Pb2+濃度在50～100 mg/L之間，三種乳酸菌活菌數(shù)緩慢下降，Pb2+濃度超過100 mg/L時，三種乳酸菌的活菌數(shù)急劇下降，當(dāng)Pb2+濃度為250 mg/L時，德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌及屎腸球菌的活菌率分別為：1.96%、2.94%、15.24%，可見海水中的高濃度的鉛離子對乳酸菌的活性影響很大，但不同乳酸菌對重金屬Pb的耐受性能不一樣，其中屎腸球菌的耐重金屬Pb的能力較強(qiáng)。

2.4?葡萄糖濃度對三種乳酸菌生長的影響

三種乳酸菌在不同葡萄糖濃度的海水中的培養(yǎng)后活菌計數(shù)的結(jié)果如表4。

由表4可知，當(dāng)葡萄糖濃度在0～40%時，德氏乳桿菌與嗜熱鏈球菌處理間菌的活性差異不明顯，但不同濃度的葡萄糖溶液處理組間對屎腸球菌活性的影響差異顯著。當(dāng)海水中葡萄糖濃度在0～20%時，隨著葡萄糖濃度的增加，三種乳酸菌的活性也在增加，當(dāng)葡萄糖濃度為20%時，乳酸菌的活菌數(shù)最大，其中德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌及屎腸球菌的活菌率分別達(dá)到101.9%、114.7%及112.3%。當(dāng)海水中葡萄糖濃度高于20%時，三種乳酸菌的生長均受到抑制，活菌數(shù)開始下降。

3?小結(jié)

在海水中，固定化乳酸菌最適生長的pH值為6.0;隨著NaCl濃度增加，三種乳酸菌的活性逐漸下降，德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌在NaCl濃度為1%～4%時活菌率分別能達(dá)80%以上，屎腸球菌耐鹽性比德式乳桿菌和嗜熱鏈球菌強(qiáng)，在濃度為8.0%以內(nèi)其活性均能保持在80%以上;加入乙酸鉛會大量抑制固定化乳酸菌生長，當(dāng)濃度大于100 mg/L時，乳酸菌大量死亡;葡萄糖可以為固定化乳酸菌的生長提供能量和碳源，最適乳酸菌生長的葡萄糖濃度為20%，當(dāng)葡萄糖濃度大于20%，三種乳酸菌的生長均受到抑制，其原因可能是乳酸菌在海水中能直接利用葡萄糖作為能源和碳源，促進(jìn)其生長，當(dāng)葡萄糖濃度過高時，易使乳酸菌細(xì)胞滲透脫水而不利于乳酸菌的生長。

參考文獻(xiàn)：

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徐希佳，包華軍.海水養(yǎng)殖環(huán)境污染以及控制對策研究[J].農(nóng)技服務(wù)，2017，34（22）：161.

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Effect ofseawater on the growth of fixed lactobacillus

MA Hongmei，TANG Chaoying，ZHANG Hanhua，PI Ziyao，YU Zhonghua

（College of Fisheries Life Science ，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572022）

Abstract：The effects of pH value，NaCl concentration，Pb2+ concentration and glucose concentration on the growth of immobilized lactic acid bacteria were determined by coating separation counting method in order to study the tolerance of immobilized lactic acid bacteria to different factors in seawater.The results showed that the pH of seawater was 6.0，and the living bacteria rates of Lactobacillus delbrueckii，Streptococcus thermophilus and Enterococcus Faecium in seawater were 98.0%，117.6% and 111.4% respectively. The addition of NaCl and lead acetate solution could inhibit the growth of lactobacillus ，but the salt tolerance and lead tolerance of Enterococcus Faeciumwere stronger than those of Lactobacillus delbrueckii，Streptococcus thermophilus. The optimum glucose concentration for the growth of lactic acid bacteria is 20%，and excessive glucose will inhibit the growth of lactic acid bacteria probably. It was concluded that Enterococcus Faecium ?had strong tolerance to pH，NaCl concentration，Pb2+ concentration and glucose variables by comparing the activities three strains of lactobacillus in seawater.

Key words：immobilization of lactobacillus; seawater;tolerance; Enterococcus Faecium

（收稿日期：2020-05-26）