游明燦，申采薇，徐玉英，任秀花，游言文△

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，鄭州 450008； 2. 鄭州大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，鄭州 450001)

神經(jīng)病理性疼痛由神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或功能障礙所致[1]。課題組前期研究顯示，其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡相關(guān)，且丹參酮IIA(tanshinone IIA，TSA)對(duì)神經(jīng)痛模型大鼠有鎮(zhèn)痛作用[2-3]，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不清楚。丹參為雙子葉植物唇形科鼠尾草植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的根莖及干燥根，有化瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、清心除煩、養(yǎng)血安神等作用。丹參酮IIA是丹參中脂溶性成分的代表，具有抗氧化和抗炎等作用[4]。文獻(xiàn)研究表明，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)的X 蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)[5-6]。為進(jìn)一步研究丹參酮IIA的鎮(zhèn)痛機(jī)制，該研究在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)與其鎮(zhèn)痛作用之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.1.1 模型制作 雄性清潔級(jí)SD大鼠45只，體質(zhì)量200～220 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為sham組(假手術(shù)組)15只和模型組30只。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在同一實(shí)驗(yàn)室按照清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)期間飲水、進(jìn)食自由。模型建立參照Bennett和Xie等[7]，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮、消毒、鋪洞巾，一次切開(kāi)皮膚、筋膜，分離骨骼肌，用6.0尼龍非吸收外科縫線結(jié)扎右側(cè)坐骨神經(jīng)(左側(cè)不結(jié)扎)，間隔1～2 mm，在主干部位系4個(gè)結(jié)。術(shù)后肌注青霉素8 U。sham組僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)干，不予結(jié)扎。建立成功模型的標(biāo)準(zhǔn)是術(shù)后出現(xiàn)自發(fā)性痛表現(xiàn)，如舔足、咬足或甩足、熱痛閾和機(jī)械痛閾明顯降低等表現(xiàn)[8]。

1.1.2 鞘內(nèi)注射丹參酮IIA 鞘內(nèi)注射是先將實(shí)驗(yàn)組大鼠用10%水合氯醛麻醉，在腰4、5或腰5、6椎間隙，常規(guī)剪毛、消毒皮膚；在顯微解剖鏡下用微量注射器刺入蛛網(wǎng)膜下腔，穿刺成功后將藥物注入大鼠蛛網(wǎng)膜下腔。45只制備成功的模型大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為處理組(TSA組)15只和生理鹽水組(NS組)30只，分別在模型組大鼠鞘內(nèi)注射丹參酮IIA 20 mg/kg或生理鹽水0.1 ml，自手術(shù)當(dāng)日開(kāi)始每日1次，連續(xù)注射14 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兔單抗Bax和Bcl-2以及鼠單抗Caspase-3均購(gòu)自Abcam公司；丹參酮IIA注射液(批號(hào)H31022558，購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司。丹參酮ⅡA的提?。旱⒓右掖肌訜峄亓?.5 h→收集粗提取液體→分子蒸餾工藝 (脫溶劑乙醇) →丹參酮ⅡA[9]。由FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Bcl-2)，由TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(Bax)和由TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(Caspase-3)，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 機(jī)械痛閾的測(cè)定

采用von Frey絲(Stoelting公司，美國(guó)) 測(cè)定3組實(shí)驗(yàn)大鼠的機(jī)械痛敏(paw withdrawal threshold,PWT)，刺激大鼠足底皮膚，觀測(cè)大鼠是否出現(xiàn)舔足、甩腿等反應(yīng)，測(cè)量3次取平均值，實(shí)驗(yàn)時(shí)每次刺激大鼠間隔時(shí)間不低于5 min(實(shí)驗(yàn)大鼠輪流檢測(cè)，有序記錄)。

1.4 熱痛閾的測(cè)定

熱刺激潛伏期(paw withdrawal thermal latency, PWTL)測(cè)定[9]，將大鼠置于有機(jī)玻璃格子內(nèi)，先讓實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)5 min，待大鼠安靜后熱源放在實(shí)驗(yàn)大鼠足底，間隔玻璃格子的底部打開(kāi)開(kāi)關(guān)儀器開(kāi)始加熱，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足逃避反射。根據(jù)前期經(jīng)驗(yàn)，刺激時(shí)間不超過(guò)20 s，同一部位2次熱刺激之間的時(shí)間間隔不低于5 min(實(shí)驗(yàn)大鼠輪流檢測(cè)，有序記錄)，連續(xù)測(cè)量3 次取平均值。

1.5 脊髓組織的獲取

在術(shù)后第14天，3組實(shí)驗(yàn)大鼠先進(jìn)行麻醉，腹腔注射10%的水合氯醛常規(guī)灌注，處死大鼠暴露并分離實(shí)驗(yàn)大鼠第3～5腰椎脊髓節(jié)段，脊髓組織完整取出后放-80 ℃保存，用于后續(xù)Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白的檢測(cè)。

1.6 免疫熒光組織化學(xué)染色

第3～5腰椎脊髓背角組織進(jìn)行石蠟包埋，切片后脫蠟，PBS浸洗后修復(fù)，再進(jìn)行PBS洗滌；每張切片加入 0.3%H2O2后PBS洗滌；血清封閉后分別加入一抗(稀釋倍數(shù)為1∶300)，37 ℃孵育后PBS洗滌。每張切片分別加入二抗(FITC標(biāo)記Bcl-2，TRITC標(biāo)記Bax和Caspase-3)，羊抗兔和羊抗鼠IgG，二抗稀釋比例為1∶100。37 ℃孵育后PBS浸洗，最后在熒光顯微鏡下觀察。

每張切片依次進(jìn)行熒光顯微鏡拍照和圖像分析。在暗室中(整個(gè)拍照過(guò)程)使用熒光正置顯微鏡進(jìn)行拍照(20×)，選取照片隨意劃取照片的5個(gè)區(qū)域，采用ImageJ(NIH)軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)改變

所有實(shí)驗(yàn)大鼠無(wú)死亡，30只模型大鼠術(shù)后健康狀況良好，進(jìn)食、飲水正常，體質(zhì)量無(wú)減輕，體毛有光澤。模型組大鼠均出現(xiàn)避免損傷側(cè)的負(fù)重行為，如自發(fā)抬起手術(shù)側(cè)肢體，舔足、咬足或甩足等行為，足趾出現(xiàn)手術(shù)側(cè)的輕微外翻或/和足趾并攏現(xiàn)象。假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)上述現(xiàn)象。

2.2 熱痛閾和機(jī)械痛閾的變化

圖1、2示，3組大鼠手術(shù)前、假手術(shù)組大鼠手術(shù)前以及手術(shù)后的熱痛閾和機(jī)械痛閾比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組比較，在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，生理鹽水組的熱痛閾和機(jī)械痛閾均明顯下降。術(shù)后第7、14天與生理鹽水組比較，處理組的熱痛閾和機(jī)械痛閾均明顯上升，但與假手術(shù)組比較各值仍較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)

1.A、D、G：假手術(shù)組；2.B、E、H：生理鹽水組；3.C、F、I：處理組圖3 各組大鼠脊髓背角中Bcl-2(A～C)、Bax(D～F) 和Caspase-3 (G～I(xiàn)) 的表達(dá)(20×)

注：與假手術(shù)組比較：﹡P<0.01；與假手術(shù)組和生理鹽水組比較：△P<0.05圖1 熱痛閾的變化

注：與假手術(shù)組比較：﹡P<0.01；與假手術(shù)組和生理鹽水組比較：△P<0.05圖2 機(jī)械痛閾的變化

圖3、4示，脊髓背角內(nèi) Bcl-2主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和核膜，Bax和Caspase-3主要分布在細(xì)胞質(zhì)。大鼠脊髓背角內(nèi)可見(jiàn)，Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白在假手術(shù)組僅有少量表達(dá)；與假手術(shù)組比較，Bcl-2、Bax和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及數(shù)量在生理鹽水組均明顯增多，Bcl-2/Bax比值下降；與生理鹽水組比較，處理組Caspase-3和Bax陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及數(shù)量明顯減少，但Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量及熒光強(qiáng)度明顯增多；Bcl-2/Bax比值較假手術(shù)組和生理鹽水組明顯升高，以上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

注：與假手術(shù)組和生理鹽水組比較：△P<0.05圖4 各組大鼠脊髓背角Bcl-2/Bax比值的比較

神經(jīng)病理性疼痛給患者帶來(lái)痛苦的同時(shí)，還給護(hù)理人員和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)，主要由疾病和創(chuàng)傷造成的周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后產(chǎn)生[10]。目前治療神經(jīng)性疼痛的藥物很少，且藥物的副作用可能會(huì)使癥狀進(jìn)一步惡化[11]。有研究報(bào)道，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制與Bcl-2、Bax和Caspase-3相關(guān)[12-13]。前期研究顯示，丹參酮IIA有鎮(zhèn)痛作用[3]，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與神經(jīng)元凋亡相關(guān)[2]。Kandhare AD等[7]報(bào)道，神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠坐骨神經(jīng)中神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加，Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯增加，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低。Bcl-2對(duì)細(xì)胞的發(fā)育、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)抑制能夠分解細(xì)胞的蛋白酶(caspases)活性以促進(jìn)細(xì)胞的存活[14]。Bax是Bcl-2氨基酸同源性家族中的一員， Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，細(xì)胞凋亡過(guò)程中由于線粒體的變化，特別是細(xì)胞色素C的釋放導(dǎo)致Caspase-9和Caspase-3的激活，從而促成死亡細(xì)胞的有效分解[15-16]。在已知的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子中，最顯著的是Bax與 Bcl-2的比值，由于Bcl-2的下調(diào)，當(dāng)Bax與 Bcl-2的比值明顯增大時(shí)，隨后細(xì)胞色素C的釋放，導(dǎo)致Caspase-3激活，使細(xì)胞凋亡率增加[16-17]。

丹參具有祛瘀生新、活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛等功效[5]。丹參酮IIA磺酸鈉(sodium tanshinone IIA sulfonate，STS)是二萜醌類(lèi)化合物丹參酮IIA 經(jīng)磺化而得到的水溶性磺酸鹽，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制與Bcl-2的表達(dá)升高有關(guān)[18]。丹參酮IIA能通過(guò)抗腦水腫、抗氧化、抗凋亡等對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠起到較好的神經(jīng)保護(hù)作用[19]。在本研究中，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生是模型大鼠外周神經(jīng)受到損傷，鞘內(nèi)注射丹參酮IIA后，隨著脊髓背角內(nèi)Bcl-2的表達(dá)增多，Bax和Caspase-3的表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值增大，機(jī)械痛閾和熱痛閾的升高，因此丹參酮IIA的鎮(zhèn)痛作用可能與增加脊髓背角Bcl-2的表達(dá)、降低Bax和Caspase-3的表達(dá)相關(guān)，但其鎮(zhèn)痛作用的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。