龔 玲，劉代順，朱紅蘭

(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(遵義市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)，貴州 遵義 563002)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病[1]，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難，并伴隨肺功能下降，該病病因不清，病變局限在肺臟，其特征表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎，該病每年以11%的比例增長[2-3]。IPF診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，因此被稱為一種“類腫瘤疾病”[4]。姜黃素(curcumin, Cur)是二酮類化合物，近年的研究表明，它有一些新的藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗纖維化以及防癌等作用，且無明顯的毒副作用[5-7]。Smith MR等[8]報(bào)道，姜黃素可通過抑制TGF-β/Smad信號通路表達(dá)，從而抑制肺纖維化的形成。Lin J等[9]報(bào)道，在肝星狀細(xì)胞中，姜黃素通過刺激PPAR-γ(peroxisome proliferater activated receptor, PPAR-γ)生成增加，從而抑制PDGF-β(platelet derived growth factor, PDGF-β)下游PI3K/AKT、ERK及JNK信號通路傳導(dǎo)來抑制肝纖維化的發(fā)生。但是姜黃素在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中是否具有同樣的作用，還有待進(jìn)一步的考究。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過PPAR-γ配體羅格列酮、PDGF-β探討姜黃素在小鼠肺成纖維細(xì)胞中的抗纖維化分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究及臨床治療肺纖維化提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞(CRL-6013TM)購自美國American Type Culture Collection(ATCC)公司，實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均為第2～3代。

1.2 藥物

姜黃素(C1386)購于美國Sigma Aldrich公司，10 mg/瓶，姜黃素純度>99.5%，分子式：[HOC6H3(OCH3)CH=CHCO]2CH2，分子量：368.38。羅格列酮(Rosi)(R2408)購于美國Sigma Aldrich公司，10 mg/支，羅格列酮純度>98%，分子式：C18H19N3O3S，分子量：357.43。

1.3 試劑

PPAR-γ兔抗小鼠(美國 Cellsignal)；PDGFR-β兔抗小鼠(美國 Cellsignal)；TGF-β2(美國 R&D Systems)；辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國 Cellsignal)；Trizol試劑(美國Invitrogen)；PCR試劑盒(日本TaKaRa)；PCR引物合成(中國 生工)；DMEM(美國 Hyclone)；瓊脂糖(美國Cambrex公司)；ELISA試劑盒(美國 R&D Systems公司)；MTT試劑盒(中國凱基公司)；DNA marker(日本TaKaRa公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞懸液移入塑料離心管中，加入DMEM培養(yǎng)基10 mL，混勻后低速離心5 min，小心棄上清液。重新加入DMEM(含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)基重新混勻細(xì)胞，應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，活細(xì)胞率95%，以每瓶1×106個(gè)/ml接種到10 cm2培養(yǎng)皿中，放置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2～3 d換液，細(xì)胞長至70%～80%融合狀態(tài)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞藥物處理

參照文獻(xiàn)[10]，TGF-β2刺激濃度為10ng/ml。參照文獻(xiàn)[11]，姜黃素使用二甲基亞楓溶解，刺激濃度為5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L。參照文獻(xiàn)，Rosi[12]用二甲基亞楓溶解，刺激濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后設(shè)置調(diào)零孔，未處理組UNT，細(xì)胞分為TGF-β2組(10 ng/mL)、TGF-β2(10 ng/mL)+姜黃素組(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)、TGF-β2(10 ng/mL)+羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，檢測生長抑制作用時(shí)吸去孔內(nèi)上清液。酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀檢測各孔在490 nm處吸光光度并記錄其結(jié)果。

1.7 細(xì)胞生長形態(tài)觀察

相同密度的細(xì)胞分別接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取姜黃素、羅格列酮最佳濃度，將細(xì)胞分為空白組、TGF-β2 10ng/mL+姜黃素組50 μmol/L、TGF-β2 10ng/mL+羅格列酮組40 μmol/L，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.8 RNA提取及聚合酶鏈反應(yīng)

細(xì)胞分為空白組、TGF-β2組(10 ng/mL)、TGF-β2(10 ng/mL)+姜黃素組(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)、TGF-β2(10 ng/mL)+羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后使用Trizol試劑提取總RNA，測定A260/A280吸光度判斷純度和濃度后，取2 μL總RNA使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄DNA。PCR反應(yīng)過程：反應(yīng)體系25 μL，94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)PCR循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。檢測PPAR-γmRNA、PDGF-βmRNA光密度值。

表1 PCR引物序列

1.9 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取姜黃素、羅格列酮最佳濃度，將細(xì)胞分為空白組、TGF-β2 10ng/mL+姜黃素組50 μmol/l、TGF-β2 10ng/mL+羅格列酮組40 μmol/L，藥物干預(yù)48 h后采用Western blot法檢測。實(shí)驗(yàn)步驟詳見參考文獻(xiàn)[14]。放射自顯影后凝膠成像儀內(nèi)掃描，圖像分析軟件(Quantity One4.1) 進(jìn)行分析，以PPAR-γ、PDGFR-β的吸光度比值進(jìn)行相對定量。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取姜黃素、羅格列酮最佳濃度，將細(xì)胞分為空白組、TGF-β2 10ng/mL+姜黃素組50 μmol/L、TGF-β2 10ng/mL+羅格列酮組40 μmol/l，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基，離心提取上清后作為待測樣品，實(shí)驗(yàn)步驟詳見參考文獻(xiàn)[13]。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞活力、增殖情況

圖1、2示，在TGF-β2刺激下，C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞活力、增殖均隨姜黃素及羅格列酮濃度梯度增加和時(shí)間梯度增加受到明顯抑制，TGF-β2+姜黃素組50 μmol/L在48、72 h時(shí)抑制C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞活力、增殖最明顯，TGF-β2+羅格列酮組40 μmol/L在48、72 h時(shí)抑制C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞活力、增殖最明顯(P<0.05)。

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞用TGF-β210 ng/ml及不同濃度Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)分別作用，培養(yǎng)(0、24、48、72 h)后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。圖A為Cur實(shí)驗(yàn)組，圖B為Rosi實(shí)驗(yàn)組。 Cur實(shí)驗(yàn)組與空白組比較：P=0.000；Rosi實(shí)驗(yàn)組與空白組比較：P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 姜黃素、羅格列酮對C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞活力的影響

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞用TGF-β210ng/ml及TGF-β210 ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分別作用，培養(yǎng)(0、24、48、72 h)后進(jìn)行鏡下觀察圖2 姜黃素、羅格列酮對C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響(×200)

2.2 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表達(dá)水平影響

圖3示，姜黃素和羅格列酮均使PPAR-γmRNA表達(dá)上調(diào)且存在明顯濃度依賴，姜黃素在50 μmol/L時(shí)PPAR-γmRNA表達(dá)上調(diào)最明顯，羅格列酮在40 μmol/L時(shí)PPAR-γmRNA表達(dá)上調(diào)最明顯。姜黃素和羅格列酮均使PDGF-βmRNA表達(dá)下調(diào)且存在明顯濃度依賴，姜黃素在50 μmol/L時(shí)PDGFR-βmRNA表達(dá)下調(diào)最明顯，羅格列酮在40 μmol/L時(shí)PDGF-βmRNA表達(dá)下調(diào)最明顯(P<0.05)。

2.3 PPAR-γ、PDGFR-β蛋白表達(dá)

圖4示，在TGF-β2刺激下，PPAR-γ蛋白表達(dá)增加，但當(dāng)加入姜黃素及羅格列酮后，PPAR-γ蛋白表達(dá)增加更明顯，說明姜黃素和羅格列酮均存在促進(jìn)PPAR-γ蛋白生成增加的作用。在TGF-β2刺激下，PDGFR-β蛋白表達(dá)增加，但當(dāng)加入姜黃素及羅格列酮后，PDGFR-β蛋白表達(dá)降低，說明姜黃素和羅格列酮均存在抑制PDGFR-β蛋白生成增加的作用(P<0.05)。

2.4 膠原蛋白-1生成影響

圖5示，TGF-β2誘導(dǎo)膠原-1生成增加，但當(dāng)加入姜黃素和羅格列酮后膠原-1生成減少，說明姜黃素和羅格列酮均抑制TGF-β2誘導(dǎo)膠原-1的生成(P<0.05)。

3 討論

IPF主要表現(xiàn)為彌漫性肺間質(zhì)纖維化伴隨輕度炎癥，成纖維細(xì)胞灶與正常肺組織并存，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的大量增生和沉積，使蜂窩組織的形成。該病典型臨床表現(xiàn)為咳嗽、咳痰，動(dòng)則氣短、干咳、喘憋，后期出現(xiàn)進(jìn)行性呼吸困難，還具有慢性、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)。根據(jù)病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)，該病屬于中醫(yī)學(xué)“喘證” “肺脹” “氣短” “痰飲” “咳嗽” “肺痹” “肺痿”等范疇。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肺纖維化尚無有效的治療措施。從近些年中醫(yī)藥治療肺纖維化的研究文獻(xiàn)中可以看到，隨著中醫(yī)辨證辨病治療對該病病因病機(jī)研究的深入，中醫(yī)藥在治療和控制該病上顯現(xiàn)出越來越大的優(yōu)勢，中醫(yī)可以減輕咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀，增加動(dòng)脈血氧分壓，縮短病程，改善生活質(zhì)量等。但總體而言，本病研究尚處于起步階段，因此利用中醫(yī)學(xué)尋求有效的治療方法，對IPF診治具有深遠(yuǎn)意義。

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞用TGF-β210 ng/ml及不同濃度Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)和Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)分別作用24 h后用PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PPAR-γmRNA、PDGF-βmRNA檢測。左圖為TGF-β2+ Cur(5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)檢測PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表達(dá)，右圖為 TGF-β2+Rosi(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)檢測PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA表達(dá)。結(jié)果使用表示，姜黃素實(shí)驗(yàn)組：*P=0.002，羅格列酮實(shí)驗(yàn)組：*P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖3 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA在不同濃度姜黃素、羅格列酮刺激下的表達(dá)

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞用TGF-β210 ng/ml及TGF-β210ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分別作用，培養(yǎng)24 h后用Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PPAR-γ、PDGFR-β蛋白檢測。左圖為檢測PPAR-γ蛋白表達(dá)，右圖為檢測PDGFR-β蛋白表達(dá)。結(jié)果使用表示，TGF-β2刺激組與Rosi組比較：*P=0.000，TGF-β2刺激組與Cur組比較：*P=0.000，TGF-β2刺激組與Rosi組比較：**P=0.000，TGF-β2刺激組與Cur組比較：**P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖4 姜黃素、羅格列酮對PPAR-γ、PDGFR-β蛋白表達(dá)的影響

注：C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞用TGF-β210 ng/ml及TGF-β210ng/ml+Cur 50 μmol/L和TGF-β210ng/ml+Rosi 40 μmol/L分別培養(yǎng)24 h，用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行膠原-1檢測。結(jié)果使用表示， Cur及Rosi 實(shí)驗(yàn)組分別與空白組比較：*P=0.019，*P=0.01，Cur及Rosi 實(shí)驗(yàn)組分別與TGF-β2刺激組比較：**P=0.005，**P=0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖5 姜黃素及羅格列酮對膠原蛋白-1的影響

姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物根莖中提取的一種化學(xué)成分，其中姜黃約含3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮的色素，為二酮類化合物[11]。隨著對姜黃素研究的日益深入，已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抗纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅可以刺激PPAR-γ表達(dá)增加，還可以使PDGF-β表達(dá)下調(diào)。PPAR-γ表達(dá)增加不僅會抑制細(xì)胞增殖及活力，還可以使膠原-1表達(dá)減少，從而導(dǎo)致肺纖維化形成受阻。此外，PPAR-γ促使PDGF-β表達(dá)下調(diào)后可進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及凋亡增加，細(xì)胞增殖及活力受到抑制，同樣可以阻礙肺纖維化形成。Lin J[10]等學(xué)者通過肝星狀細(xì)胞證實(shí)，姜黃素可以通過刺激PPAR-γ表達(dá)增加，從而阻止PDGF-β下游信號通路的傳導(dǎo)來抑制肝纖維化發(fā)生。因此，通過本實(shí)驗(yàn)推測，在TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，姜黃素刺激PPAR-γ表達(dá)增加后促使PDGF-β表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致PDGF-β下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信號通路傳導(dǎo)受抑制，肺成纖維細(xì)胞增殖和活力受抑制，膠原-1合成表達(dá)減少，肺纖維化形成受影響。但是為驗(yàn)證這一機(jī)制是否合理，還需要利用姜黃素通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

PDGF-β作為PDGF的受體亞單位，僅與PDGF B鏈有高親和力。在肝纖維化時(shí)，肝星狀細(xì)胞表面的PDGF-β與PDGF-BB結(jié)合后促進(jìn)肝纖維化發(fā)生，抑制PDGF-β及其下游信號通路的傳導(dǎo)，是抑制肝纖維化的關(guān)鍵點(diǎn)。由于PDGF-β在肝纖維化形成過程中的作用已經(jīng)比較明確，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，在C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，TGF-β2促使PDGF-β表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖及活力增加，膠原沉積表達(dá)增加，然而姜黃素卻通過刺激PPAR-γ表達(dá)增加來阻止PDGF-β及其下游信號通路傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及凋亡增加，細(xì)胞增殖及活力受到抑制，肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化受到影響，纖維化形成減少。此外結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還推測，PDGF-β表達(dá)下調(diào)可能是通過抑制其下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信號通路傳導(dǎo)來阻止纖維化的發(fā)生，這與Kulkarni AA[14]等學(xué)者所證實(shí)的PPAR-γ配體通過抑制FAK下游的PI3K/AKT信號通路傳導(dǎo)來阻止肺纖維化發(fā)生不謀而合。但為證實(shí)該機(jī)制是否正確，還需利用PDGF下游信號通路藥物深入探討。

羅格列酮是目前研究最多的PPAR-γ經(jīng)典合成配體，是PPAR-γ的高選擇性、強(qiáng)效激動(dòng)劑，與PPAR-γ親和力最大。越來越多的證據(jù)顯示，羅格列酮不僅在炎癥反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，還參與某些器官纖維化進(jìn)程，如皮膚、肝臟、肺等。通過研究還發(fā)現(xiàn)，在TGF-β誘導(dǎo)小鼠肺成纖維細(xì)胞C57BL/6分化過程中，羅格列酮通過與PPAR-γ受體結(jié)合后刺激PPAR-γ表達(dá)增加，除了抑制細(xì)胞增殖及活力以外，還抑制膠原-1的表達(dá)。

圖6 PPAR-γ/PDGF-β信號通路圖

因此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，姜黃素與羅格列酮均可通過刺激PPAR-γ表達(dá)增加，從而抑制PDGF-β表達(dá)來阻止纖維化的發(fā)生。羅格列酮作為PPAR-γ配體通過與PPAR-γ受體結(jié)合來阻止肺纖維化發(fā)生。姜黃素除本身具有抗纖維化和抗氧化作用以外，還可通過刺激PPAR-γ表達(dá)增加來阻止肺纖維化發(fā)生。

綜上所述，姜黃素和羅格列酮均有抗肺纖維化的作用，刺激PPAR-γ表達(dá)增加，從而抑制PDGF-β下游信號通路的傳導(dǎo)，可能是阻止肺纖維化的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。姜黃素對肺纖維化治療可能存在潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。