張超

摘要：為明確重慶萬州某養(yǎng)殖場紅色斑點(diǎn)叉尾鮰（Red Ictalurus punctatus）出血性敗血癥的病因，為該病的防治提供參考，采用細(xì)菌的分離純化、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA和gyrB基因測序、動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)對(duì)病原進(jìn)行了鑒定，并采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。結(jié)果：從患病紅色斑點(diǎn)叉尾鮰的內(nèi)臟中分離獲得1株優(yōu)勢菌，革蘭氏染色呈陰性，一般單個(gè)或呈雙存在，短桿狀，兩端鈍而圓;菌落圓形，表面光滑濕潤，邊遠(yuǎn)整齊，β-溶血。能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇，不能分解阿拉伯糖、乳糖、纖維二糖;氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、七葉苷水解呈陽性;尿素酶、精氨酸雙水解酶呈陰性。16S rDNA和gyrB基因測序結(jié)果與維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）同源性最高，分別達(dá)99%和100%;回歸試驗(yàn)攻毒組與臨床病例癥狀相似。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢西叮、頭孢曲松、復(fù)方新諾明較為敏感。確定該例紅色斑點(diǎn)叉尾鮰的主要病原為維氏氣單胞菌。

關(guān)鍵詞：斑點(diǎn)叉尾鮰;維氏氣單胞菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦稱溝鯰（channel catfish），屬鯰形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae），原產(chǎn)于美國密西西比河，是美國淡水養(yǎng)殖的主要品種[1]。1984年引入中國，具有適應(yīng)性廣、生長快、產(chǎn)量高、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)上乘等優(yōu)點(diǎn)，已在全國各地推廣[2]。紅色斑點(diǎn)叉尾鮰（Red Ictalurus punctatus），又稱美國紅鮰，簡稱紅鮰，是自然變異的斑點(diǎn)叉尾鮰經(jīng)長期改良選育而成的一個(gè)品種，色彩艷麗，集觀賞美食于一體，市場推廣前景更優(yōu)于普通的斑點(diǎn)叉尾鮰[3]。然而，由于養(yǎng)殖密度過大，水質(zhì)管理不當(dāng)、藥物使用不規(guī)范等原因，氣單胞菌屬（Aeromonas）致病菌導(dǎo)致的紅鮰疾病在某些養(yǎng)殖場仍呈高發(fā)趨勢，嚴(yán)重影響了紅鮰產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。2019年3月，萬州某養(yǎng)殖場紅鮰出現(xiàn)了以細(xì)菌性敗血癥并發(fā)“腸套疊”為典型癥狀的死亡，文章對(duì)該病例的病原進(jìn)行了系統(tǒng)的分離鑒定并開展了藥敏實(shí)驗(yàn)，旨在為該病的防治提供一定的參考。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

病料采集自萬州某養(yǎng)殖場，健康斑點(diǎn)叉尾鮰（平均體長15.5±10 cm，平均體重35±5 g）購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場。培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、藥敏檢測試劑盒、細(xì)菌微量生化鑒定管均購于杭州天和微生物試劑有限公司，DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均為寶生物（大連）工程有限公司產(chǎn)品，引物及基因測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1? 細(xì)菌的分離純化

取典型癥狀的病魚，無菌操作取肝臟、脾臟、腎臟、腦劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置28℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑選形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落，劃線傳代培養(yǎng)2次，純化后的菌株轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，4℃冰箱保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2? 生理生化鑒定

細(xì)菌生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]所述方法進(jìn)行。

1.2.3? 16S rDNA和gyrB基因序列分析

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢菌株的DNA。16S rDNA基因PCR擴(kuò)增引物參照分支桿菌[6]，反應(yīng)條件略有改動(dòng)。gyrB基因引物參參考Tac?o Marta [7]等，反應(yīng)體系和條件同16S rDNA。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，膠回收后克隆到T載體上，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用NCBI-Blast進(jìn)行在線序列比對(duì)。

1.2.4? 回歸感染試驗(yàn)

將市場上購買的60尾健康斑點(diǎn)叉尾鮰隨機(jī)分為4組，2組為攻毒組，2組為對(duì)照組。調(diào)整菌懸液濃度至1.0×108 CFU/mL，攻毒組每尾胸鰭基部注射0.2 mL菌液，對(duì)照組注射0.2 mL的生理鹽水。將試驗(yàn)魚放置于水溫為25℃的養(yǎng)殖箱中，每天觀察并記錄魚的發(fā)病和死亡情況，持續(xù)時(shí)間為兩周，同時(shí)對(duì)瀕臨死亡或已死亡的魚進(jìn)行剖檢和病原菌的再次分離鑒定。

1.2.5? 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法。取濃度為1.0×108 CFU/mL的菌液0.2 mL均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈的直徑，敏感性判定參照試劑盒說明書。

2? 結(jié)果

2.1? 臨床癥狀

取池塘中患病斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行剖檢，可見肝腎脾等主要臟器出現(xiàn)不同程度的充血、出血，邊緣張力明顯，并有局部壞死，尤其是脾臟更為明顯?？梢娔c道內(nèi)充滿淡黃色膿性分泌物，腸壁稀薄，炎癥明顯，同時(shí)可以觀察到“腸套疊”。

2.2? 細(xì)菌形態(tài)

分離菌株革蘭氏染色呈陰性，一般單個(gè)或呈雙存在，短桿狀，兩端鈍而圓（圖1）。菌落呈圓形，表面光滑濕潤，邊遠(yuǎn)整齊。在血平板上長勢良好，有β-溶血現(xiàn)象。

2.3? 生理生化特性

分離菌株能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇，不能分解阿拉伯糖、乳糖、纖維二糖。氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、七葉苷水解呈陽性，尿素酶、精氨酸雙水解酶呈陰性。結(jié)合菌落和細(xì)菌形態(tài)觀察，初步判定分離株為維氏氣單胞菌[8]。

2.4? 動(dòng)物人工感染實(shí)驗(yàn)

每日觀察并記錄實(shí)驗(yàn)魚狀況，包括行為、癥狀和死亡情況。攻毒組斑點(diǎn)叉尾鮰在人工感染3 d后，出現(xiàn)活力下降，游動(dòng)無力現(xiàn)象，體表和鰭條基部充血，5 d內(nèi)發(fā)病魚占攻毒總數(shù)的70%，而注射無菌生理鹽水的對(duì)照組未見異常?？梢姳砥こ鲅砀髦饕K器充血腫大;再次分離到的菌株與原代菌株形態(tài)，生理生化和序列分析結(jié)果一致，說明分離株為該病例的致病病原。

2.5? 基因擴(kuò)增結(jié)果

16S rDNA測序后獲得1505bp的基因片段，Blast結(jié)果與維氏氣單胞菌的同源性最高，達(dá)99%;gyrB序列為198bp，與維氏氣單胞菌同源性達(dá)100%（圖2）。

2.6? 藥敏試驗(yàn)

分離株對(duì)10種抗菌藥的敏感性差異比較大。對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢西叮、頭孢曲松、復(fù)方新諾明較為敏感，中度敏感的有苯唑西林、紅霉素、卡那霉素，對(duì)青霉素G、克林霉素、氨芐西林表現(xiàn)為耐藥。

3? 討論

細(xì)菌性敗血癥并發(fā)“腸套疊”為鮰魚的臨床常見癥狀，4～6月份高發(fā)，病程一般呈慢性經(jīng)過，持續(xù)死魚達(dá)10天以上，累積死亡率達(dá)50%左右。從全國來看，各地發(fā)病癥狀有所差異，分離鑒定的主要病原也不盡相同，可能性病原有鮰魚愛德華氏菌、柱狀屈撓桿菌、氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌四類[9]。維氏氣單胞菌隸屬氣單胞菌屬，為典型的條件致病菌，能侵染大多數(shù)的淡水養(yǎng)殖魚類，尤其水質(zhì)條件變差時(shí)，能引起魚類大批死亡[10]。

10種抗菌藥敏感試驗(yàn)顯示，分離株對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢西叮、頭孢曲松等較為敏感，對(duì)青霉素G、克林霉素、氨芐西林等6種藥物表現(xiàn)為耐藥，與高金偉等[8]的結(jié)果不一致，這可是流行株的區(qū)域分布差異造成的。2019年9月中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了最新的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》，水產(chǎn)上常用的三種抗菌藥為恩諾沙星、氟苯尼考和復(fù)方磺胺甲噁唑（復(fù)方新諾明），本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明分離株對(duì)這三種藥物敏感，臨床治療上應(yīng)優(yōu)先選用這三種抗菌藥。單純的細(xì)菌性出血病在比較容易治療，一旦誘發(fā)“腸套疊”，病程往往持續(xù)一個(gè)月以上，且治療效果往往不理想。生產(chǎn)上應(yīng)以綜合防控為主：①定期檢測水質(zhì)，采用微生態(tài)制劑調(diào)水;②在開食或轉(zhuǎn)食期間、疾病高發(fā)期間加強(qiáng)巡塘，做到對(duì)疾病的“早發(fā)現(xiàn)、早治療”;③日常投喂嚴(yán)格遵守“三看、四定”原則;④定期開展魚病檢查。

參考文獻(xiàn)

[1] 李林，嚴(yán)朝暉，肖友紅.斑點(diǎn)叉尾鮰國內(nèi)市場現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景淺析[J].中國水產(chǎn)，2012 （09）：35-36.

[2] 嚴(yán)朝暉，肖友紅，李林.世界鲇魚產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及對(duì)我國斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)市場定位的重新認(rèn)識(shí)[J].中國水產(chǎn)，2013 （06）：36-40.

[3] 喬燕平，張晨晨.紅色和黑色斑點(diǎn)叉尾魚回人工繁殖試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科技情報(bào)， 2006（03）：118-120.

[4] 楊移斌，胥寧，董靖，等.斑點(diǎn)叉尾鮰病原中溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性分析[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)， 2017，7（04）：45-50.

[5]? 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2001：114-116.

[6]? Ucko M， Colorni A， Kvitt H， Diamant? A ， et al. Strain variation in Mycobacterium marinum fish isolates[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（11）：5281-5287.

[7] Tac?o Marta， Alexandra M ， Artur A ， et al. Evaluation of 16S rDNA- and gyrB-DGGE for typing members of the genus Aeromonas[J]. FEMS Microbiology Letters，2005（246）：11-18.

[8] 高金偉，梁利國，王亞冰，等. 鱖源致病性維氏氣單胞菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2016，043（12）：2686-2692.

[9] 蔡焰值，雷曉中，汪亮，等. 斑點(diǎn)叉尾鮰重要疾病發(fā)病原因及預(yù)防措施[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010. 49（11）：2867-2871.

[10] 陳昌福.我們應(yīng)該如何反思斑點(diǎn)叉尾鮰大量死亡的現(xiàn)象.[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2017.42（06）：77-78.