朱亞偉 王立濤 安娟艷 呂慕潔 孫建航 郭 娜 付玉杰*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；3.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083；4.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150000)

桑(MorusalbaL.)屬于?？?Moraceae)桑屬(Morus)的喬木或灌木，原產(chǎn)我國中部和北部，現(xiàn)東北至西南各省區(qū)，西北直至新疆均有栽培[1]。桑葉不僅可以作為桑蠶的飼料，而且也是最常用的傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解表、疏散風(fēng)熱、清肝明目之功效[2]。桑葉中的活性物質(zhì)主要有桑葉多糖、多酚、黃酮、生物堿、氨基酸以及維生素等[3]，具有防治糖尿病、降低血壓、抗氧化、抗炎[4]等藥理作用。其中桑葉多糖(Mulberry leaves polysaccharides，MLPs)是桑葉的主要活性成分，具有多種生物活性，如降糖、抗炎、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等[5]。隨著人們健康意識的提高，對綠色食品的需求與日俱增，桑葉多糖受到了越來越多研究者的關(guān)注。程等[6]研究指出，桑葉多糖主要由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖等單糖組成。Wu[7]通過α-淀粉酶輔助法提取了桑葉多糖MLP-1，通過動物實驗指出MLP-1具有抑制腎纖維化的能力以及治療糖尿病性腎病的潛力；Zhang等[8]研究指出，MLPsⅡ可抑制糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡和改善胰島β細(xì)胞分泌胰島素的能力；Yuan等[9]研究指出，通過熱水提取法得到的粗MLPs及其純化餾分，通過體外研究，發(fā)現(xiàn)粗MLPs及其純化餾分均表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性，特別是具有清除超氧化物，ABTS自由基以及和Fe2+螯合的能力。目前對于桑葉多糖的提取方法主要有：超聲提取法、酶——超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓提取法、熱水——酶輔助提取法等[10]。其中酶解法具有耗能少，時間短以及提取的多糖品質(zhì)高等特點，并且提取工藝簡便，處理條件溫和。微波輔助提取法相比其他傳統(tǒng)提取方法，具有升溫快速均勻、熱效率高、無污染、溶劑回收率高等優(yōu)點，可大大縮短提取時間，提高萃取率，節(jié)約成本。此外，當(dāng)前以酶——微波輔助提取法進(jìn)行桑葉多糖的提取未見報道。

因此本研究以桑葉多糖提取率為考察指標(biāo)，采用酶解——微波輔助提取法，在單因素條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，結(jié)合具有試驗次數(shù)少、周期短、精度高的Box-Behnken(BBD)-Response Surface Methodolog(RSM)響應(yīng)面法進(jìn)行桑葉多糖提取工藝的優(yōu)化，以期獲得桑葉多糖提取率較高的方法，為工業(yè)化提取桑葉多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉，2018年采自于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)林場(127°37′26″E，45°43′20″N)，置鼓風(fēng)干燥烘箱，45℃烘干至恒重，并粉碎至60目以下；纖維素酶，無水葡萄糖購自阿拉丁(上海)試劑有限公司；苯酚、濃硫酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YP2002型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；BT25S型電子天平，德國Sartorius公司；WFH-203型紫外分析儀，上海精科實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

本研究采用苯酚—硫酸法測定桑葉中的桑葉多糖含量[11]，精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100.00 mg于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容，搖勻后準(zhǔn)確吸取10 mL該溶液，用蒸餾水稀釋定容至100 mL，即得100 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于7只試管中，分別補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，然后再分別加入濃度為5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫，同時用蒸餾水的反應(yīng)液做空白，通過分光光度計在波長490 nm處測定吸光值，以吸光度A為縱坐標(biāo)(y)，桑葉多糖濃度為橫坐標(biāo)(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品溶液的制備

取適量桑葉樣品，加酶作用后，微波提取，減壓過濾得到濾液，備用。

1.3.3 多糖含量與提取率的測定

精密吸取樣品溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容。然后精密量取0.125 mL稀釋后樣品溶液和0.875 mL蒸餾水(稀釋80倍)于10 mL容量瓶中，加蒸餾水補(bǔ)至2 mL，然后再加入1.0 mL濃度為5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后置水浴中，40℃加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫，同時用2.0 mL蒸餾水做空白，使用分光光度計在波長490 nm處測定吸光度。根據(jù)桑葉多糖的回歸曲線方程求得其濃度。桑葉多糖提取率的計算公式：

桑葉多糖含量/%=(桑葉多糖質(zhì)量/桑葉粉末質(zhì)量)×100%

(1)

1.4 桑葉多糖提取的單因素試驗

分別以超聲輔助提取法(Ultrasonic assisted extraction,UAE)、酶解——超聲輔助提取法(Enzymolysis-ultrasonic assisted extraction,EUAE)、微波輔助提取法(Microwave assisted extraction,MAE)、酶解——微波輔助提取法(Enzymolysis-microwave assisted extraction,EMAE)，以及酶濃度(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解溫度(20、30、40、50和60℃)、pH(3、4、5、6、7)、酶解時間(20、30、40、50和60 min)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗，考察這5個因素對桑葉多糖提取率的影響，每組單因素試驗重復(fù)3遍。

1.5 BBD-RSM優(yōu)化桑葉多糖的提取

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在預(yù)實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取液固比、提取時間和提取溫度3實驗因素進(jìn)行3因素和3個水平實驗，并對桑葉多糖提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，實驗因素及水平見表1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在相同條件下通過分光光度計測定不同濃度桑葉多糖的吸光度，以桑葉多糖濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)濃度下桑葉多糖的吸光度為縱坐標(biāo)，得到桑葉多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

擬合出的回歸方程為y=0.006 5x+0.024 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8，說明在20～120 μg·mL-1范圍中桑葉多糖與其吸光度之間線性關(guān)系良好，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于后續(xù)實驗分析。

圖1 桑葉多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of MLPs

2.2 桑葉多糖提取的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取方法的篩選

提取方法是影響桑葉多糖提取率的重要因素，不同的提取方法機(jī)理各不相同，提取效果各異，因此本研究考察了不同提取方法對桑葉多糖提取率的影響。如圖2所示，超聲輔助提取法提取桑葉多糖時，其提取率為10.06%，采用酶解——超聲輔助提取法時提取率升高至10.75%，采用酶解——微波輔助提取法桑葉多糖的提取效果最好，提取率為12.72%。因此本研究采用酶解——超聲輔助提取法進(jìn)行桑葉多糖的提取。

圖2 不同提取方法對桑葉多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction methods on extraction yield of MLPs

圖3 酶濃度、酶解溫度、pH、酶解時間對桑葉多糖提取率的影響Fig.3 Effects of enzyme concentration, enzymolysis temperature, pH, and enzymolysis time on extraction yield of MLPs

2.2.2 酶濃度、酶解溫度、pH、酶解時間對桑葉多糖提取率的影響

合適的酶濃度既可以最大限度的提高桑葉多糖的提取率，還可以節(jié)約酶試劑，減少資源的浪費。如圖3A所示，酶濃度從1%升高至2%時，桑葉多糖的提取率得到了增加，但隨著酶濃度的逐步增加，桑葉多糖的提取率呈現(xiàn)先降低后穩(wěn)定的趨勢，主要因為當(dāng)酶濃度為2%時是酶活的最適濃度，酶濃度小于2%時，酶濃度偏低，酶解速率受限，當(dāng)酶濃度大于2%，酶濃度的增加抑制了酶活性，造成桑葉多糖的提取率降低，因此桑葉多糖提取的最佳酶濃度為2%。

由于在酶解反應(yīng)中，酶解溫度顯著影響酶活性，進(jìn)而影響桑葉多糖的提取率，因此本研究考察了酶解溫度對桑葉多糖提取率的影響。由圖3B所示，隨著溫度的升高，桑葉多糖的提取率呈現(xiàn)先降低后急劇增高的趨勢，當(dāng)酶解溫度為50℃時，桑葉多糖的提取率最高，較20℃升高了36.45%，但當(dāng)溫度升高至60℃時桑葉多糖的提取率降至最低。這是因為在20～50℃時，隨著溫度的升高，纖維素酶的活性和分子運動速率都得到增強(qiáng)，從而加速了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，但過高的溫度可能會降低酶的活性，造成桑葉多糖提取率的降低。因此，桑葉多糖提取時的酶解溫度為50℃。

在桑葉多糖提取過程中，pH也是通過影響酶活性進(jìn)而影響桑葉多糖的提取率。由圖3C所示，隨著pH值的升高，桑葉多糖的提取率基本呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)pH為6時，酶活性最高，酶促反應(yīng)效率最好，桑葉多糖提取率最高，當(dāng)高于或低于此pH時，酶活降低，酶解速率減弱，桑葉多糖提取率降低。因此，提取桑葉多糖時的pH選擇為6。

如圖3D所示，當(dāng)酶解時間從20 min增加至60 min過程中，桑葉多糖的提取率基本呈現(xiàn)先降低后穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)酶解時間為20 min時桑葉多糖的提取率最高，隨著酶解時間的延長，酶解反應(yīng)變得復(fù)雜，可能是因為生成其他非糖物質(zhì)的含量增加，從而造成桑葉多糖提取率降低。因此，桑葉多糖提取的最適酶解時間為20 min。

2.3 桑葉多糖的BBD-RSM分析

2.3.1 桑葉多糖提取工藝的BBD分析

在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，選擇液固比、提取時間和提取溫度進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)曲面分析法，對桑葉多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定桑葉多糖的最佳提取條件，實驗結(jié)果見表2。實驗結(jié)果采Design-Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到桑葉多糖提取得率(%)對液固比X1(mL·g-1)、提取時間X2(min)和提取溫度X3(℃)的二次多項回歸方程:Y=-192.85+3.73X1+2.39X2+4.27X3+8.61×10-3X1X2+0.01X1X3-1.08×10-3X2X3-0.15X12-0.10X22-0.03X32。

2.3.2 桑葉多糖提取工藝的方差分析

為了檢驗方程的有效性，對桑葉多糖提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3。從表3可以看出，模型P<0.000 1，說明該回歸模型達(dá)到了極顯著水平，而失擬項P>0.05不顯著，同時模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 2，表明該回歸模型擬合程度良好。此外，模型的修正相關(guān)系數(shù)AdjR2=0.982 2，說明該擬合方程很好的反映了液固比、提取時間以及提取溫度與桑葉多糖提取率的關(guān)系。從該回歸模型的方差分析還可以看出，液固比和提取時間對桑葉多糖提取率的影響極顯著，二次項中X12,X22,X32的影響均達(dá)到極顯著水平。因此，該模型可以用于對桑葉多糖的提取進(jìn)行分析與預(yù)測。

圖4 酶水解微波輔助提取桑的反應(yīng)面 A.提取時間和液固比；B.提取溫度和液固比；C.提取溫度和提取時間Fig.4 The response surfaces of enzymolysis-microwave assisted extraction of MLPs A.Varying extraction time and liquid/solid ratio; B.Varying temperature and liquid/solid ratio; C.Varying temperature and extraction time

表2 從桑葉中提取桑葉多糖的Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果

Table 2 Results of the Box-Behnken design for the extraction of MLPs from mulberryM.albaL. leaves

序號No.因素FactorsX1(La,mL·g-1)X2(tb,min)X3(Tc,℃)桑葉多糖提取率YieldofMLP(%)1-1(10)-1(5)0(75)4.2121(20)-1(5)0(75)7.963-1(10)1(15)0(75)8.1141(20)1(15)0(75)12.735-1(10)0(10)-1(65)5.5561(20)0(10)-1(65)9.677-1(10)0(10)1(85)4.4281(20)0(10)1(85)11.4790(15)-1(5)-1(65)5.95100(15)1(15)-1(65)10.82110(15)-1(5)1(85)7.26120(15)1(15)1(85)11.91130(15)0(10)0(75)13.98140(15)0(10)0(75)14.63150(15)0(10)0(75)14.28160(15)0(10)0(75)14.61170(15)0(10)0(75)14.63

注：a.液固比(mL·g-1)；b.提取時間(min)；c.提取溫度 下同。

Note:a.Liquid/solid ratio(mL·g-1);b.Extraction time(min);c.Extraction temperature(℃) The same as below.

表3 從桑葉中提取桑葉多糖的二次模型的方差分析統(tǒng)計

Table 3 ANOVA statistics of the quadratic model for the extraction yield of MLPs from mulberryM.albaL. leaves

變量Variables平方和Sumofsquares自由度df均方和MeansquareF值F-valueP值P-value模型Model226.44925.1698.99<0.0001SignificantXa147.74147.71187.70<0.0001Xb241.39141.39162.85<0.0001Xc31.1911.194.670.0675X1X20.1910.190.730.4216X1X32.1612.168.490.0225X2X30.01210.0120.0460.8363X1257.41157.41225.87<0.0001X2225.95125.95102.10<0.0001X3236.83136.83144.90<0.0001失擬項Lackoffit1.440.0635NotsignificantR20.9922AdjR20.9822

2.2.3 響應(yīng)面分析

通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗得到各因素之間交互作用的三維立體圖，液固比、提取時間、提取溫度的交互作用如圖4所示。由圖4A可以看出，隨著提取時間的延長，桑葉多糖得率逐漸增高，提取時間達(dá)到12 min后，桑葉多糖的提取率趨于平衡，隨著液固比的增大，桑葉多糖的提取率先增大后減小。由提取溫度與液固比對桑葉多糖提取率的交互影響的響應(yīng)面(圖4B)可以看出，溫度升高，桑葉多糖提取率增加，同時由于溫度升高，桑葉多糖的降解也加劇，因此，溫度過高不利于桑葉多糖的提取，隨著液固比的增加，桑葉多糖的提取率也呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。由提取溫度與提取時間對桑葉多糖提取率的交互影響的響應(yīng)面(圖4C)可以看出，提取時間增加，有助于提取的進(jìn)行，但提取時間過長，也會引起桑葉多糖的部分降解，溫度太低不利于反應(yīng)的進(jìn)行，太高反而會造成桑葉多糖水解。綜上所述，液固比、提取時間、提取溫度之間存在明顯的交互作用。

2.4 優(yōu)化提取參數(shù)與實驗驗證

在建立的數(shù)學(xué)模型的基礎(chǔ)上，獲得最佳實驗條件如下：液固比15.59 mL·g-1，提取時間13.29 min，提取溫度75.92℃，相應(yīng)的桑葉多糖提取率為15.12%?？紤]到桑葉多糖提取時的實際操作，將液固比，提取時間和提取溫度分別修改為15 mL·g-1，13 min和76℃，此時MLPs的實際提取率為15.23%，與預(yù)測值之間的相對誤差僅為0.72%，建立的模型真實可靠。

3 結(jié)論

本研究以桑葉多糖提取率為考察指標(biāo)，在考察不同的提取方法、酶濃度、酶解溫度、pH、酶解時間5個單因素的基礎(chǔ)上，結(jié)合BBD-RSM方法優(yōu)化了液固比、提取時間、提取溫度。該模型擬合程度較高，能夠適用于桑葉多糖提取條件的優(yōu)化，最終獲得了桑葉多糖的最佳提取條件：采用酶解—微波輔助提取法，在酶含量2%、酶解溫度50℃、pH6、酶解時間20 min、液固比15 mL·g-1、提取時間13 min、提取溫度76℃，在此條件下桑葉多糖的實際提取率為15.23%，與預(yù)測值之間的相對誤差僅為0.72%，模型真實可靠。本研究為桑葉多糖的開發(fā)利用提供了重要的研究基礎(chǔ)，具有一定的潛在應(yīng)用價值。