王欣宇 李弘琨 于 良 趙雪蓮 于雪瑩 付玉杰*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，哈爾濱 150040；3.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040)

白藜蘆醇，又稱芪三酚，是一種天然的二苯乙烯類化合物，在葡萄、花生、虎杖等植物中都有存在[1]，具有抗腫瘤、抗菌、抗衰老、保護(hù)心血管、抗氧化等多種活性[2～5]。但是白藜蘆醇屬于脂溶性物質(zhì)，基本不溶于水，在水中的溶解度只有0.3 mg·L-1[6]。水溶性差和易氧化等不穩(wěn)定的理化性質(zhì)都對白藜蘆醇的生物利用度有很大的影響，因此，近年來人們嘗試使用微納米載體技術(shù)包裹白藜蘆醇，以解決其應(yīng)用上現(xiàn)存的一些問題。

微納米載體技術(shù)可以保護(hù)活性成分，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，使其便于運(yùn)輸貯藏。脂質(zhì)作為生物活性成分的載體在脂溶性生物活性成分的傳遞體系中得到普遍的認(rèn)同，以脂質(zhì)作為微納米載體的基礎(chǔ)，其良好的生理性質(zhì)使微納米載體系統(tǒng)尺寸可以縮小到微米或亞微米，制備工藝簡單，也容易放大生產(chǎn)，可以使親脂性化合物的生物利用度大大提高[7]。

現(xiàn)在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)是常用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域的一種微納米載體系統(tǒng)，是第二代脂質(zhì)納米粒，是在傳統(tǒng)固體脂質(zhì)納米粒和油/水型乳狀液的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[8～10]，它由固態(tài)脂質(zhì)和液態(tài)脂質(zhì)的混合物構(gòu)成，在常溫下也呈現(xiàn)固態(tài)。固態(tài)脂質(zhì)在加入液態(tài)脂質(zhì)后產(chǎn)生晶格缺陷，其結(jié)晶形式發(fā)生變化，要包裹的活性成分可以被容納其中，使其負(fù)載量升高[11]，同時(shí)又避免了活性成分在傳統(tǒng)體系運(yùn)輸貯藏過程中可能發(fā)生的滲漏現(xiàn)象。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體已經(jīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域及化妝品行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用[12～13]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

白藜蘆醇、油酸、單硬脂酸甘油酯、吐溫80、硬脂醇、月桂醇硫酸鈉、白凡士林、甘油、橄欖油、羥苯甲脂、LO2細(xì)胞等。

1.2 主要儀器

YP2002型分析天平；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋；Ultra-Turax T25型超高速電子攪拌機(jī)；SIM細(xì)胞培養(yǎng)箱；NANO高壓微射流均質(zhì)儀；DL-CJ-2N生物潔凈工作臺(tái)；Zetasizer Nano ZS90型粒度儀；Milli-Q型純水儀；CytoFLEX流式細(xì)胞儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高壓均質(zhì)法制備白藜蘆醇脂質(zhì)載體

本研究中選擇溶劑高壓均質(zhì)法作為制備白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的方法。首先以溶解度為指標(biāo)，對脂質(zhì)進(jìn)行篩選，將篩選出的的固態(tài)脂質(zhì)和液態(tài)脂質(zhì)混合，控制水浴溫度高于固態(tài)脂質(zhì)熔點(diǎn)5～10℃，將混合脂質(zhì)熔化后混勻。再使用高速剪切分散機(jī)在1 000 r·min-1的條件下將一定量的白藜蘆醇加入混合脂質(zhì)中形成油相。水相即為在相同的水浴溫度下混勻的乳化劑和去離子水。之后使用高速剪切分散機(jī)在1 000 r·min-1的條件下將混勻的水相用注射器勻速、緩慢地加入相同溫度的油相中，攪拌5分鐘，這樣就形成了初乳[14]，之后選擇合適的條件進(jìn)行高壓均質(zhì)，即得到白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

脂質(zhì)的篩選：稱取2 g脂質(zhì)置于圓底燒瓶中，在75℃的水浴鍋中以800 r·min-1的速度進(jìn)行磁力攪拌，加入2 mg白藜蘆醇攪拌一定時(shí)間，若白藜蘆醇溶解完全，則繼續(xù)加入白藜蘆醇，直至其不能完全溶解或冷卻后會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶，選擇溶解能力較好的脂質(zhì)[15]。

1.3.2 包封率的測定

超濾離心法：取白藜蘆醇納米脂質(zhì)載體加入1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，超聲處理，使游離藥物充分溶解，再將混合溶液加到截留分子量為100 kD的超濾離心管中，10 000 r·min-1離心10 min，取濾液用流動(dòng)相稀釋，液相檢測；取等量白藜蘆醇納米脂質(zhì)載體，加入甲醇，超聲處理使其破乳，進(jìn)而測定總藥物含量。藥物包封率計(jì)算公式如下：

EE%=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%

(1)

式中：Wtotal為總藥物含量，Wfree為未包裹藥物含量。

色譜條件為甲醇∶0.3%磷酸水=65∶35(流動(dòng)相)，柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，在306 nm條件下檢測。

1.3.3 MTT法檢測白藜蘆醇和白藜蘆醇脂質(zhì)載體對細(xì)胞的影響

用10%的細(xì)胞培養(yǎng)基對LO2細(xì)胞進(jìn)行稀釋，使細(xì)胞的數(shù)量為1×105mL。將100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液加入96孔板，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液吸出，將白藜蘆醇和白藜蘆醇脂質(zhì)載體用稀釋培養(yǎng)基稀釋到規(guī)定濃度后加入，體積為100 μL。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞處理完畢后，向每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，把上清液吸出后向每個(gè)孔中加入100 mL DMSO，把孔板置于微型振蕩器中輕微震蕩10 min后在570 nm處對每個(gè)孔的吸光值進(jìn)行測定。至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長抑制率計(jì)算公式如下：

細(xì)胞生長抑制率(%)=(OD加藥組/OD對照組)×100%

(2)

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測白藜蘆醇脂質(zhì)體清除ROS能力

用10%的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋處于對數(shù)生長期的LO2細(xì)胞，使細(xì)胞的濃度為1×106mL。向6孔板加入2 mL細(xì)胞液，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h，藥物保護(hù)組分別加入濃度為50 μmol·L-1的白藜蘆醇和白藜蘆醇脂質(zhì)載體，在空白組和H2O2模型分別加入DMEM溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，在除空白組以外的其他各組中均加入濃度為600 μmol·L-1的H2O2，孵育12 h。待細(xì)胞經(jīng)藥物處理完畢后，向各組細(xì)胞中加入已配置好的DCFH-DA溶液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再放置20 min。每隔幾分鐘輕輕搖晃使其充分混勻，待處理完畢后用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)法制備白藜蘆醇脂質(zhì)載體

2.1.1 脂質(zhì)和乳化劑的篩選

本實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)為脂質(zhì)對白藜蘆醇的溶解度，結(jié)果見表1。本實(shí)驗(yàn)篩選了實(shí)驗(yàn)室常見的固態(tài)脂質(zhì)、液態(tài)脂質(zhì)各3種，試驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇在單硬脂酸甘油酯和油酸中溶解度較好，因此，本實(shí)驗(yàn)采用單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，油酸為液態(tài)脂質(zhì)。

表1 脂質(zhì)篩選結(jié)果

注：“—”表示不能夠溶解完全；“±”表示加熱時(shí)能夠溶解，但冷卻后有結(jié)晶析出；“+”表示能夠溶解完全，冷卻后也沒有結(jié)晶析出。

Note:“—”means can’n be completely dissoloved；“±”means can be dissoloved during heating,but crystal precipitation after cooling；“+”means can be dissoloved,and no crystal precipitation after cooling

乳化實(shí)驗(yàn)則是依據(jù)親水親油平衡原理，以乳化能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來進(jìn)行乳化劑的篩選。本實(shí)驗(yàn)選擇了3種實(shí)驗(yàn)室常見的親水性乳化劑，對它們的乳化能力進(jìn)行篩選，結(jié)果如表2所示。其中4%的吐溫80形成的乳液穩(wěn)定性較好，離心后也不出現(xiàn)分層，因此，本實(shí)驗(yàn)選取吐溫80為乳化劑，添加量為4%。

表2 乳化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“—”表示冷卻會(huì)分層；“±”表示冷卻不分層，離心會(huì)分層；“+”表示離心也不發(fā)生分層現(xiàn)象

Note:“—”means stratification occurs after cooling；“±”means no stratification occurs after cooling,but stratification occurs after centifugation；“+”means no stratification occurs after centifugation

圖1 固液脂質(zhì)比例對粒徑的影響Fig.1 Effect of solid-liquid lipid ratio on particle size

2.1.2 固液脂質(zhì)比例的篩選

固液脂質(zhì)比例影響藥物包封率，進(jìn)而影響粒徑。如果液體脂質(zhì)太少，則不能夠破壞固態(tài)脂質(zhì)的晶格結(jié)構(gòu)，造成藥物裸露，從而導(dǎo)致體系粒徑變大；而液體脂質(zhì)太多又不利于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的形成，本實(shí)驗(yàn)選取固液脂質(zhì)比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、：1∶2、1∶3進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)固液脂質(zhì)比例為1∶1時(shí)，體系的平均粒徑最小，因此選擇固液脂質(zhì)比為1∶1。

圖2 均質(zhì)壓力對粒徑的影響Fig.2 Effect of homogeneous pressure on particle size

圖3 均質(zhì)次數(shù)對粒徑的影響Fig.3 The influence of homogenization degree on particle size

2.1.3 熱高壓均質(zhì)壓力及循環(huán)次數(shù)的確定

高壓均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)都對納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑有著非常重要的影響。一般來講粒徑在提高均質(zhì)壓力和增加循環(huán)次數(shù)后都會(huì)降低，但是對于不同的油脂/乳化劑體系有各自最適合的均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)，在超過這個(gè)條件之后，粒徑反而會(huì)變大。

本實(shí)驗(yàn)分別在300、400、500、600和700 bar的條件下對白藜蘆醇初乳進(jìn)行處理。如圖2所示，體系的平均粒徑隨著均質(zhì)壓力的改變而變化。當(dāng)均質(zhì)壓力低于600 bar時(shí)，隨著均質(zhì)壓力的升高體系的平均粒徑從234 nm減小至179 nm。當(dāng)均質(zhì)壓力繼續(xù)上升時(shí)，體系平均粒徑不降反升，這可能是由于體系的溫度隨著均質(zhì)壓力增大而逐漸升高，致使體系中的液滴發(fā)生聚集，進(jìn)而導(dǎo)致其平均粒徑變大。因此，選擇均質(zhì)壓力為600 bar。

本實(shí)驗(yàn)分別選擇循環(huán)次數(shù)1、2、3、4和5次對白藜蘆醇初乳進(jìn)行處理。如圖3所示，體系的平均粒徑隨著均質(zhì)次數(shù)的改變而發(fā)生變化。當(dāng)均質(zhì)次數(shù)小于3次時(shí)，平均粒徑隨著均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的増加而減小，從255 nm降到179 nm。而當(dāng)繼續(xù)增加均質(zhì)次數(shù)時(shí)，體系平均粒徑變化不明顯甚至回升。因此，綜合考慮，選擇均質(zhì)次數(shù)為3次。

綜上，確定以單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，油酸為液態(tài)脂質(zhì)，二者比例為1∶1，吐溫80為乳化劑，添加量為4%，在均質(zhì)壓力為600 bar的條件下均質(zhì)3次，此時(shí)制備的白藜蘆醇脂質(zhì)載體平均粒徑最小，可降低至179.6±1.7 nm，在水中的分散度也良好，此時(shí)藥物包封率為85.33%。

2.1.4 傅里葉變換近紅外光譜分析(FTIR)

圖4為白藜蘆醇、單硬脂酸甘油酯以及白藜蘆醇脂質(zhì)載體的紅外圖譜。白黎蘆醇粉末的紅外圖譜在1 608 cm-1(苯環(huán)上碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)峰)，1 592 cm-1(烯烴上碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)峰)和966 cm-1(反式碳碳雙鍵的特征峰)處具有較強(qiáng)的吸收峰。白藜蘆醇的這些主要特征吸收峰在其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)載體上也依舊存在，這表明白黎蘆醇在其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)載體制備過程中并沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。

圖4 傅里葉變換近紅外光譜Fig.4 FTIR of Res(a),GMS(b),Res-NLC(c)

圖5 白藜蘆醇及其脂質(zhì)載體對L02細(xì)胞的毒性試驗(yàn)a.白藜蘆醇處理12 h；b.白藜蘆醇脂質(zhì)載體處理12 h；c.白藜蘆醇處理24 h；d.白藜蘆醇脂質(zhì)載體處理24 hFig.5 Effects of resveratrol and resveratrol NLC on L02 cells a.Treated with resveratrol for 12 h; b.Treated with resveratrol NLC for 12 h; c.Treated with resveratrol for 24 h; d.Treated with resveratrol NLC for 24 h

圖6 白藜蘆醇及其脂質(zhì)載體清除ROS能力Fig.6 ROS scavenging capacity of resveratrol and Res-NLC

2.2 MTT法檢測白藜蘆醇和白藜蘆醇脂質(zhì)載體對細(xì)胞的影響

如圖5所示，白藜蘆醇和白藜蘆醇脂質(zhì)載體隨著濃度升高，細(xì)胞死亡率越高。白藜蘆醇處理時(shí)間為12和24 h，濃度低于200 μmol·L-1時(shí)并未對細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性。白藜蘆醇脂質(zhì)體處理時(shí)間12和24 h，濃度低于100 μmol·L-1時(shí)未對細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性。綜合考慮，我們選擇50 μmol·L-1的白藜蘆醇和白藜蘆醇脂質(zhì)載體作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測白藜蘆醇脂質(zhì)載體清除ROS能力

外源性過氧化氫(H2O2)可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)分解產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ROS含量急劇增加。DCFH-DA是一種最常用的活性氧熒光檢測探針，其本身不產(chǎn)生熒光，卻能穿過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部后，水解生成不可以透過細(xì)胞的DCFH，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。我們通過對熒光強(qiáng)度進(jìn)行測試，確定白藜蘆醇脂質(zhì)體清除ROS的能力。

如圖6所示，濃度為600 μmol·L-1的H2O2溶液作用12 h后，相比于空白對照組，H2O2損傷組DCF在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯增加。然而預(yù)先加入50 μmol·L-1白藜蘆醇脂質(zhì)載體和白藜蘆醇原料藥的實(shí)驗(yàn)組處理12 h后，DCF的熒光強(qiáng)度有所下降，并且白藜蘆醇脂質(zhì)載體對ROS的清除能力強(qiáng)于白藜蘆醇原料藥。

3 結(jié)論

本研究采用高壓均質(zhì)法制備白藜蘆醇脂質(zhì)載體，研究結(jié)果表明白藜蘆醇脂質(zhì)載體顯著降低了藥物粒徑，在水中分散度良好。首先以脂質(zhì)對白藜蘆醇溶解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定以單硬脂酸甘油酯為固態(tài)脂質(zhì)，油酸為液態(tài)脂質(zhì)。再以穩(wěn)定性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定以4%吐溫80為乳化劑。以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定固液脂質(zhì)比例為1∶1，均質(zhì)壓力為600 bar，循環(huán)3次時(shí)得到的白藜蘆醇脂質(zhì)載體粒徑最小，為179 nm，此時(shí)藥物包封率為85.33%。MTT實(shí)驗(yàn)和ROS清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明白藜蘆醇脂質(zhì)載體濃度低于100 μmol·L-1時(shí)未對細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性，并且有優(yōu)于白藜蘆醇原料藥的抗氧化活性。通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以為白黎蘆醇在醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。