毛安琪,魏春英

(山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006)

0 引言

以DNA為模板合成的銀納米簇(DNA-Ag NCs)是一種新興材料,由于其毒性小、生物相容性好以及易調(diào)節(jié)的發(fā)射波長，近幾年來受到了研究者們的關(guān)注,被廣泛應(yīng)用于金屬離子和生物小分子的檢測[1]。此外,科學(xué)家也致力于改善DNA-Ag NCs的物理及化學(xué)性質(zhì),研究表明富G序列靠近DNA-Ag NCs能顯著增強其熒光強度[2]。根據(jù)這一特性,借助多種DNA適配體和獨特的二級結(jié)構(gòu),DNA-Ag NCs被成功應(yīng)于生物成像[3]及核酸序列的“turn on”檢測[4]。

L-組氨酸是人類和其他哺乳動物必需的氨基酸,它控制著金屬元素的轉(zhuǎn)運,同時也是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。L-組氨酸的咪唑側(cè)鏈?zhǔn)墙饘俚鞍酌钢谐Ｒ姷呐潴w,在某些酶的催化位點上起著重要的作用。研究表明,L-組氨酸水平異常可引起心理障礙、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性耳聾等多種疾病[5]。鑒于L-組氨酸在人體中的重要性,人們已經(jīng)建立了液相色譜法[6]、毛細管電泳法[7]、電化學(xué)方法[8]、熒光法[9]等檢測方法,其中熒光探針具有較高的選擇性和靈敏度,在L-組氨酸檢測中具有較好的應(yīng)用前景。盡管用于L-組氨酸檢測的熒光傳感器的開發(fā)已經(jīng)取得了顯著的進展,但目前常見的小分子染料和量子點探針存在毒性大、光穩(wěn)定性差、合成困難等不足[10]。因此仍有必要開發(fā)新型熒光傳感器用于組氨酸檢測。

采用包含富G和富C序列的單鏈DNA模板合成了發(fā)射波長為593 nm的DNA-Ag NCs,測試了其紫外可見吸收和熒光性質(zhì),并借助Ni2+對DNA-Ag NCs熒光的猝滅以及Ni2+和L-His的強配位相互作用,實現(xiàn)了對L-His的“turn on”檢測。

1 實驗部分

1.1 材料

AgNO3(質(zhì)量分數(shù)99.8%),NaBH4(質(zhì)量分數(shù)98%), Ni(NO3)2,2-甲基苯并咪唑為分析純,半胱氨酸(Cys),胱氨酸(Cys-Cys),同型半胱氨酸(Hcy),谷氨酸(Glu),谷氨酰胺(Gln),谷胱甘肽(GSH),L-組氨酸(L-His),羥基脯氨酸(Hypo),蘇氨酸(Thr)和色氨酸(Trp)為高級純,均購于上海阿拉丁生物科技股份有限公司。無水乙醇、1-乙烯基咪唑和咪唑均為分析純,分別購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司、安耐吉化學(xué)、和生工生物工程(上海)股份有限公司。胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司。研究中使用的寡聚單鏈DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列如下:

C-T30695:5′-TTTACCCACCCACCCACCCAAA-3′,C-T30695-G:5′-TTTACCCACCCACCCACCCAAAGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3′

1.2 DNA-Ag NCs的合成

DNA-Ag NCs按照文獻報道的方法合成[11],具體如下:將初始濃度為100 μmol/L的DNA貯存液稀釋于pH=7.4的PBS-K+(20 mmol/L) 緩沖溶液中,加入硝酸銀溶液,充分混勻,放入4℃冰箱避光孵育20 min。隨后在上述溶液中加入10 mmol/L的NaBH4溶液(需現(xiàn)配現(xiàn)用)混合均勻,4℃冰箱繼續(xù)避光孵育1 h合成DNA-Ag NCs。體系中DNA、硝酸銀和NaBH4的終濃度分別為3,18,18 μmol/L。合成的DNA-Ag NCs儲存在室溫下用于后續(xù)實驗。

1.3 光譜測定

熒光光譜在FL 4600型熒光光譜儀上測試。如非特殊說明,測量時采用的DNA-Ag NCs濃度為0.6 μmol/L,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,測定溫度為室溫。紫外可見吸收光譜利用Cary 50 Bio紫外可見光譜儀測試,測量時使用的DNA-Ag NCs濃度為3 μmol/L。透射電鏡(TEM)測試使用儀器為JEM-2100透射電子顯微鏡。測試時使用20 μmol/L DNA-Ag NCs,與無水乙醇1∶1混合均勻后取10 μL滴加在銅網(wǎng)上,干燥后測試。熒光壽命測試在FL 920瞬態(tài)熒光光譜儀上完成,使用405 nm皮秒激光器作為激發(fā)光源,DNA-Ag NCs樣品濃度為0.6 μmol/L。參考Stern-Volmer方程[12]作為判斷動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅的依據(jù):

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+ksv[Q]

τ0/τ=1+kqτ0[Q]=1+kD[Q]

方程中F和F0分別為加入及未加入猝滅劑時的熒光強度,τ和τ0為加入及未加入猝滅劑時體系的平均熒光壽命,kq為分子猝滅常數(shù),ksv為SV方程常數(shù),kD是動力學(xué)猝滅常數(shù),[Q]為猝滅劑濃度。根據(jù)SV方程,當(dāng)τ0/τ=1時,猝滅過程為靜態(tài)猝滅;猝滅過程為純動態(tài)猝滅時,F0/F和τ0/τ對猝滅劑濃度[Q]作圖均呈線性,并且F0/F=τ0/τ。

1.4 胎牛血清中檢測

取胎牛血清稀釋100倍,加入標(biāo)準(zhǔn)L-His溶液。將上述溶液加入0.6 μmol/L C-T30695-G-Ag NCs體系中,使加入L-His的終濃度分別為40 μmol/L, 80 μmol/L和160 μmol/L測定體系593 nm處熒光強度,通過測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到檢測結(jié)果,通過計算回收率判斷該方法的可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA-Ag NCs的性質(zhì)

DNA-Ag NCs的性質(zhì)如圖1所示。由圖1A可見,C-T30695-Ag NCs的吸收峰位于450 nm,最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為470和550 nm,254 nm手提紫外燈照射下可觀察到黃綠色熒光,自然光照射下為淡黃色(圖1A插圖)。然而,在模板中加入富G序列后合成的C-T30695-G-Ag NCs的最大吸收峰紅移到520 nm,最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長也分別紅移至515和593 nm,同時熒光發(fā)射強度增強約6倍(圖1B)?？梢娫诤铣赡０逯刑砑痈籊序列后,不僅DNA-Ag NCs的熒光強度顯著增強,而且最大發(fā)射波長由黃綠光波段移至橙光波段,擴大了其在生物成像中的應(yīng)用前景。由圖1B插圖也可以觀察到C-T30695-G-Ag NCs溶液在254 nm手提紫外燈照射下發(fā)射明亮的橙色熒光,自然光下呈現(xiàn)淡粉色。由圖1C和圖1D可見C-T30695-Ag NCs與C-T30695-G-Ag NCs均為分散良好的球形結(jié)構(gòu),粒徑無明顯差別。

2.2 Ni2+對C-T30695-G1-Ag NCs的熒光猝滅

如圖2A所示,隨Ni2+的加入C-T30695-G-AgNCs(下文中簡稱為Ag NCs)的熒光減弱。將最大發(fā)射波長593 nm處熒光強度對Ni2+離子濃度作圖(圖2A插圖),發(fā)現(xiàn)在100 μmol/L左右可分為兩部分線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為F1=-3.968 9[Ni2+]+1 660,R2=0.965 9;F2=-1.573 1[Ni2+]+1 373,R2=0.971 5。Ni2+離子加入過少,熒光體系不能有效猝滅,檢測線性范圍窄;Ni2+離子加入過多,L-His會先和游離的Ni2+反應(yīng),影響L-His的檢測靈敏度。因此,為了實現(xiàn)對L-His的高效檢測,需要選擇適當(dāng)濃度的Ni2+。結(jié)果表明,當(dāng)加入的Ni2+大于100 μmol/L時對L-His靈敏度相對變差(數(shù)據(jù)未詳細列出),因此選擇在0.6 μmol/L Ag NCs中加入100 μmol/L Ni2+繼續(xù)以下研究。

進一步研究Ni2+加入對Ag NCs的影響,向Ag NCs中逐步滴加Ni2+測得不同Ni2+濃度下Ag NCs的熒光壽命。將熒光壽命τ0/τ和熒光強度F0/F對Ni2+離子濃度作圖(圖2B),發(fā)現(xiàn)當(dāng)Ni2+濃度為0～120 μmol/L時二者斜率幾乎相同,根據(jù)SV方程得到動力學(xué)猝滅常數(shù)kD=4.46×103mol/L,ksv=4.43×103mol/L,屬于動態(tài)猝滅。當(dāng)加入的Ni2+濃度大于120 μmol/L時τ幾乎不再變化,此時應(yīng)歸于為靜態(tài)猝滅,可能是由于Ni2+與G堿基和/或Ag NCs發(fā)生了相互作用[5,13]。

圖1 Ag NCs的性質(zhì)。(A) C-T30695-Ag NC和(B) C-T30695-G1-Ag NCs的(a)熒光激發(fā)光譜,(b)熒光發(fā)射光譜和(c)紫外可見吸收光譜;(C)C-T30695-Ag NCs 和(D) C-T30695-G1-Ag NCs 的TEM圖。

2.3 L-His對猝滅體系的恢復(fù)

如圖3A所示,0.6 μmol/L Ag NCs溶液中加入100 μmol/L Ni2+后熒光明顯猝滅,繼續(xù)加入200μmol/L的L-His 熒光得到恢復(fù),這應(yīng)該是由于L-His與Ni2+的強相互作用。紫外可見吸收光譜表明(圖3B),向3 μmol/L Ag NCs中加入500 μmol/L Ni2+和1 mmol/LL-His,520 nm處吸收峰幾乎未發(fā)生變化,推測Ni2+和L-His可能只與G堿基作用,而不是和Ag NCs直接作用。

2.4 L-His的檢測

由圖4A可見,向Ag NCs-Ni2+體系中加入L-His后1 min熒光強度不再變化,因此選擇1 min作為反應(yīng)時間,實現(xiàn)對L-His的快速檢測。圖4B為逐漸向Ag NCs-Ni2+體系中滴加L-His的熒光光譜,發(fā)現(xiàn)隨著L-His濃度增大熒光逐漸增強。取593 nm處熒光強度對L-His濃度作圖(圖4B插圖),發(fā)現(xiàn)在20～160 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性,線性回歸方程為F=2.745 3[Ni2+]+1 381.8,R2=0.996 6,檢出限為4.17 μmol/L(σ=3),線性范圍為20～160 μmol/L。人體血液中組氨酸含量為20～200 μmol/L[14],本文方法的測定范圍與之相匹配,具有實際應(yīng)用前景。

圖2 Ni2+對銀納米簇?zé)晒庑阅艿挠绊憽?A)不同濃度Ni2+對Ag NCs熒光強度的影響,插圖為593 nm處Ag NCs熒光強度與[Ni2+]的關(guān)系;(B) F0/F和τ0/τ分別對[Ni2+]作圖

圖3 Ni2+和L-His對銀納米簇?zé)晒夂妥贤饪梢娢盏挠绊憽?/p>

圖4 Ag NCs對L-His的檢測

2.5 選擇性

如圖5所示,向0.6 μmol/L Ag NCs與100 μmol/L的Ni2+混合溶液中分別加入200 μmol/L不同氨基酸、咪唑,1-乙烯基咪唑,和2-甲基苯并咪唑的水溶液,發(fā)現(xiàn)Trp,Thr,Met,Hypo,Glu,Gln,Cys-Cys對體系熒光強度幾乎沒有影響,GSH,Hcy和Cys會引起體系的強烈猝滅。這是GSH,Hcy和Cys結(jié)構(gòu)中含有的巰基與Ag NCs中的Ag生成Ag-S鍵引起的。由于GSH,Hcy和Cys都具有還原性,可以考慮通過加入NEM掩蔽劑消除干擾[15]。相比其他氨基酸Ag NCs對于L-His具有較好的選擇性,應(yīng)該是由于L-His特有的咪唑基團與Ni2+配位。進一步測試表明,向Ag NCs-Ni2+體系中加入咪唑和其他含有咪唑基團的化合物如1-乙烯基咪唑和2-甲基苯并咪唑,熒光不能恢復(fù)。因此,L-His引起的熒光恢復(fù)應(yīng)該歸于組氨酸中的咪唑N和氨基N原子共同與Ni2+配位,只含有咪唑基團的化合物與Ni2+配位能力不及組氨酸與Ni2+配位能力強,無法消除Ni2+對G堿基的作用。

圖5 Ag NC對L-His檢測的選擇性。

2.6 實際應(yīng)用

為評價Ag NCs體系的應(yīng)用價值,我們在稀釋100倍胎牛血清中檢測了L-His,實驗結(jié)果(表1)顯示該方法回收率在99.2%～105.3%之間,具有較好的回收率。結(jié)果表明,Ag NCs作為L-His傳感器可以在胎牛血清環(huán)境中實現(xiàn)對L-His快速、準(zhǔn)確的檢測,具有潛在的實際應(yīng)用價值。

表1 胎牛血清中對L-His的檢測

3 結(jié)論

本文通過在富C序列(C-T30695)末端連接富G序列合成了C-T30695-G-Ag NCs,與使用僅含有富C序列的模板相比,發(fā)現(xiàn)C-T30695-G-Ag NCs熒光強度增強,發(fā)射波長紅移至橙光波段。此納米簇體系加入Ni2+后,由于Ni2+與G堿基間的相互作用使DNA-Ag NCs熒光強度猝滅,當(dāng)加入L-His后,由于L-His與Ni2+的強配位作用使熒光得到恢復(fù),從而實現(xiàn)對L-His的檢測,檢出限為4.17 μmol/L,線性范圍為20～160 μmol/L,并能夠?qū)崿F(xiàn)在胎牛血清環(huán)境中對L-His的檢測。