王曉菊,王云俠,張彩紅*

(1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 山西 太原 030006)

0 引言

小分子量生物硫醇 (RSH) 在調(diào)節(jié)代謝、生物氧化還原、結(jié)合金屬、解毒和細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物功能方面起著關(guān)鍵作用,因此對(duì)其檢測(cè)越來越受到人們的重視[1-3]。細(xì)胞內(nèi)RSH水平異常可引發(fā)多種疾病,如心血管疾病、肝臟損傷、阿爾茨海默病、代謝紊亂、腎臟疾病等[4-6]。半胱氨酸(Cys)可以通過二硫鍵促進(jìn)生物大分子的交聯(lián),來表達(dá)蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)[7];與Cys相比,同型半胱氨酸(Hcy)多了一個(gè)亞甲基鏈,與維生素B反應(yīng)可以形成Cys[8];谷胱甘肽(GSH)在可逆氧化還原反應(yīng)中起重要作用。因此,RSH的定性和定量檢測(cè)對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防和診斷具有重要意義[9]。由于這3種硫醇化合物具有相似的結(jié)構(gòu),且報(bào)道的大多數(shù)RSH探針不能對(duì)3種硫醇進(jìn)行區(qū)分識(shí)別,因此設(shè)計(jì)出具有區(qū)別檢測(cè)某一種硫醇的新型熒光探針是目前的研究熱點(diǎn)。

到目前為止,報(bào)道的大量RSH熒光探針是基于探針與RSH之間的特異性反應(yīng)[10-11],根據(jù)機(jī)理可分為:親核取代[12]、磺胺與磺酸酯[13]的裂解、Michael加成[14]以及與納米顆粒的結(jié)合[15]等。其中,基于硫醇親核加成和分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)為作用模式的探針具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。2015年,Wong的團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種雙光子熒光探針[16],用于比率傳感線粒體中的Cys。2017年,Yin的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種以香豆素為主體的熒光探針,通過兩種不同的反應(yīng)途徑[17],以pH調(diào)節(jié)激活,其中對(duì)Cys為比率熒光響應(yīng),對(duì)Hcy為激活熒光響應(yīng)。為了進(jìn)一步研制結(jié)構(gòu)更新穎、性能更優(yōu)良的生物硫醇熒光探針,本文報(bào)道了一種新的比色比率熒光探針用于RSH的定量檢測(cè)。

在本研究中,N-丁基-4-羥基-1,8-萘二酰亞胺(BHNA)由于其良好的光學(xué)性質(zhì),如:好的光穩(wěn)定性、大的斯托克斯位移和高的熒光量子產(chǎn)率,在構(gòu)建的熒光探針中作為發(fā)光單元;α,β-不飽和烯酸酯(2,4-己二烯酸酯)作為結(jié)合硫醇的識(shí)別單元。BHNA與2,4-己二烯酸發(fā)生酯化反應(yīng)形成具有α,β-不飽和羧酸酯的熒光探針(BHENA), 酯結(jié)構(gòu)削弱了分子內(nèi)的ICT作用,當(dāng)探針BHENA與RSH作用時(shí),經(jīng)過親核加成和分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng),釋放出熒光團(tuán)BHNA,進(jìn)而使發(fā)射波長(zhǎng)紅移。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

4-溴-1,8-萘二酰亞胺,4-二甲基氨基吡啶(DMAP),乙醇,1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基二亞胺鹽酸鹽(EDC),金屬鈉,正丁胺,溴化氫,甲醇和2,4-己二烯酸等化學(xué)試劑購(gòu)于Sigma-Aldrich或Aldrich公司。GSH、Cys、Hcy、氨基酸等反應(yīng)性硫均為分析級(jí),均購(gòu)于北京化工試劑廠。

UV-265紫外可見分光光度計(jì)(島津公司,日本東京);pH計(jì)(梅特勒-托利多,瑞士);F4500熒光分光光度計(jì)(日立公司,日本東京);Bruker Avance DRX 400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀(布魯克,德國(guó))。

1.2 探針的制備及其表征

探針合成路線如圖1所示,其中兩個(gè)中間化合物依據(jù)文獻(xiàn)[18]合成。探針的合成方法:在5 mL無水的二氯甲烷溶液中加入制備好的BHNA(54.0 mg,0.2 mmol)、2,4-己二烯酸(23.0 mg,0.2 mmol)、EDC(38.0 mg,0.2 mmol)和DMAP(2.5 mg,0.02 mmol)室溫?cái)嚢柽^夜,減壓蒸餾,得到的混合物經(jīng)柱色譜分離(流動(dòng)相為乙酸乙酯/二氯甲烷=1/10,V/V),分離提純得到黃色固體BHENA(41.0 mg,產(chǎn)率56%)。1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ(ppm):δ 8.70-8.62(m,2H),8.28-8.30(d,J=2.80 Hz,1H),7.77-7.80 (t,J=2.60 Hz,1H),7.59-7.63(m,2H),6.34-6.42(m,2H),6.14-6.17(d,J=5.20 Hz,1H), 4.20-4.22(t,J=2.60 Hz,2H),1.97-1.98(d,J=1.80 Hz,3H),1.73-1.75(t,J=2.60 Hz,2H),1.45-1.49(m,2H),0.99-1.02(t,J=2.40 Hz,3H);13C NMR (100 MHz,CDCl3):δ 164.84,164.11,163.56,151.82,148.67,142.39,131.79,131.59,129.62,129.34,127.87,127.11,125.40,122.96,120.26,119.49,116.69,40.27,30.20,20.37,18.92,13.84.

1.3 紫外吸收和熒光發(fā)射光譜

在DMF溶劑中配制0.2 mmol/L探針母液。在去離子水中配制磷酸緩沖鹽溶液(PBS),在PBS緩沖液中配制Cys、GSH、Hcy等母液。光譜測(cè)量時(shí),移取探針原液加入到DMF/PBS緩沖溶液(1/9 V/V,PBS 緩沖液,pH=7.4)中。將不同濃度的RSH逐漸加入石英杯中,在室溫下80 min后進(jìn)行光譜測(cè)定,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm。激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)RSH的比率響應(yīng)和比色響應(yīng)

首先,我們研究了BHENA探針在0.05 mol/L PBS緩沖液(pH7.4,含體積百分?jǐn)?shù)10%DMF)中的光譜性能。如圖2a所示,BHENA(10 μmol/L)具有一個(gè)寬吸收帶,最大吸收在346 nm(ε=2.8×104(mol/L)-1·cm-1)。熒光光譜測(cè)定表明,BHENA在400-600 nm存在熒光發(fā)射帶,最大發(fā)射峰在468 nm。探針BHENA與Cys作用的吸收光譜和熒光光譜如圖2a所示,在加入100 μmol/L Cys后,探針BHENA在346 nm的吸收峰強(qiáng)度降低,同時(shí)在452 nm(ε=2.5×104(mol/L)-1·cm-1)處新的吸收峰出現(xiàn)。另外,肉眼可以觀察到溶液從無色到黃色的明顯變化(圖2a插圖)。熒光光譜的變化表現(xiàn)為原來468 nm的發(fā)射峰強(qiáng)度降低,同時(shí)在長(zhǎng)波區(qū)556 nm出現(xiàn)新的發(fā)射峰。對(duì)應(yīng)地,在365 nm紫外燈下溶液的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S綠色。當(dāng)探針分別與Hcy和GSH作用時(shí),也可以觀察到類似的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。這些結(jié)果表明,BHENA探針可以通過比率和顏色兩種方法識(shí)別RSH。

圖1 探針BHENA的合成路線

探針BHENA對(duì)Cys的熒光滴定光譜變化如圖2b所示。在390 nm激發(fā)下,BHENA的發(fā)射峰處于468 nm,隨著半胱氨酸Cys (0-100 μmol/L) 的加入,468 nm熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低,而一個(gè)新的發(fā)射峰在556 nm處出現(xiàn)并逐漸增強(qiáng)。其比率熒光信號(hào)F556/F468隨Cys濃度增加,從0.17增強(qiáng)至4.13,增強(qiáng)了24倍。當(dāng)Cys的濃度超過100 μmol/L時(shí),熒光比率信號(hào)基本穩(wěn)定。進(jìn)一步分析比率信號(hào)和生物硫醇濃度的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)比率熒光信號(hào)F556/F468和Cys在10～100 μmol/L濃度范圍呈線性關(guān)系(圖2b插圖),根據(jù)IUPAC的規(guī)定 (CDL=3 Sb/m) 計(jì)算得到探針對(duì)Cys的檢出限為5.3 μmol/L。類似地,利用熒光光譜分別對(duì)探針BHENA與GSH和Hcy相互作用也進(jìn)行了研究,如圖2c和圖2d所示。探針對(duì)GSH檢測(cè)范圍為10～50 μmol/L,對(duì)Hcy的檢測(cè)范圍為10～100 μmol/L,對(duì)應(yīng)的檢測(cè)限分別為4.2 μmol/L和5.5 μmol/L。上述結(jié)果表明,BHENA可以用于RSH的定量檢測(cè)。

2.2 反應(yīng)時(shí)間和pH影響

為了更好地理解BHENA與RSH作用的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),在室溫下開展了探針對(duì)生物硫醇的響應(yīng)時(shí)間研究,結(jié)果如圖3a所示,在RSH存在的情況下,468 nm處的發(fā)射強(qiáng)度逐漸減小,而556 nm處的發(fā)射強(qiáng)度增大。探針對(duì)3種不同結(jié)構(gòu)的生物硫醇響應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間相差較大,當(dāng)溶液體系中加入Cys后,比率熒光信號(hào)F556/F468在80 min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定,而探針對(duì)GSH和 Hcy的響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)140 min以上。

體系pH對(duì)探針和生物硫醇相互作用的影響如圖3b,探針自身的熒光強(qiáng)度在 pH=2～12 范圍內(nèi)變化小。當(dāng)加入RSH后,在pH=6～12有較強(qiáng)的比率熒光響應(yīng),在pH=2～6范圍內(nèi),熒光信號(hào)基本無變化,這可能是因?yàn)樗嵝詶l件抑制了羥基酯保護(hù)基團(tuán)的裂解,研究結(jié)果表明該探針可用于生理環(huán)境下RSH的檢測(cè)。

2.3 探針BHENA對(duì)RSH的選擇性研究

良好的選擇性是探針應(yīng)用的前提,為了評(píng)估探針對(duì)生物硫醇的選擇性,在相同的溶液體系中,我們對(duì)探針 (10 μmol/L) 和各種氨基酸和陰離子的相互作用進(jìn)行了考察(圖4)。Cys,GSH,Hcy(均為100 μmol/L)和其他氨基酸:L-組氨酸(His),L-谷氨酸(Glu),L-天冬酰胺(Asp),L-纈氨酸(Val),L-苯丙氨酸 (Phe),L-酪氨酸(Tyr),L-丙氨酸(Ala),L-絲氨酸(Ser),L-亮氨酸(Leu),L-精氨酸(Arg),L-脯氨酸(Pro),L-蘇氨酸(Thr),L-谷氨酰胺(Glu),L-色氨酸(Trp),L-異亮氨酸(Ile),L-賴氨酸(Lys)(均為1 mmol/L)分別與探針作用80 min后檢測(cè)其比率熒光強(qiáng)度。從圖4a中可以看出,Cys存在時(shí),BHENA的熒光比率信號(hào)(F556/F468)明顯升高;與Cys相比,GSH和Hcy有一定程度的增強(qiáng);其他氨基酸,在相同條件下未觀察到明顯的熒光變化。這一結(jié)果證明探針對(duì)RSH有一定的選擇性,探針對(duì)3種RSH作用的不同,主要是由于作用時(shí)間的差異導(dǎo)致的,探針與Cys的作用時(shí)間比Hcy和RSH要快。進(jìn)一步考察非巰基氨基酸對(duì)Cys檢測(cè)的干擾情況,當(dāng)1 mmol/L不含巰基的氨基酸和100 μmol/L Cys共存時(shí),探針的比率熒光信號(hào)仍明顯增強(qiáng),說明探針對(duì)Cys的檢測(cè)不受這些氨基酸的干擾。

圖2 a) 探針BHENA(10 μmol/L)與半胱氨酸(100 μmol/L)在室溫下作用80 min的紫外吸收和熒光光譜圖。

圖3 探針(10.0 μmol/L)與RSH(1.0 mmol/L)相互作用受時(shí)間 (a)和pH (b)的影響

圖4 a) 探針(10.0 μmol/L)在分別加入RSH(100.0 μmol/L),氨基酸(1 mmol/L)以及非巰基氨基酸和Cys的混合物后比率熒光強(qiáng)度變化圖;b) 探針(10.0 μmol/L)在分別加入RSH (100.0 μmol/L),常見陰離子 (1.0 mmol/L) 以及陰離子和Cys的混合物后比率熒光強(qiáng)度變化圖。測(cè)試在25℃下,作用80 min

2.4 機(jī)理推測(cè)

根據(jù)探針BHENA對(duì)硫醇RSH的熒光檢測(cè),圖5給出了它們可能的作用機(jī)制。當(dāng)Cys加入后,首先發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),接著進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng),同時(shí)釋放出環(huán)狀副產(chǎn)物和BHNA,導(dǎo)致體系的熒光在長(zhǎng)波發(fā)射和比率信號(hào)的改變?，F(xiàn)將0.1 mmol的探針和1.0 mmol Cys在DMF∶PBS緩沖溶液(1∶9 V/V,PBS緩沖液,pH=7.4)中反應(yīng)1.5 h后,可分離出新物質(zhì),并通過1HNMR (1H NMR(300 MHz,CDCl3) δ 11.87(s,1H),8.52(d,1H,J=8.6),8.46(d,1H,J=8.1),8.34(d,1H,J=7.5),7.75(t,1H,J=8.2),7.14(d,1H,J=7.3),4.00(t,2H,J=4.4),321.52-1.62(m,2H),1.28-1.36(m,2H),0.88-0.92(t,3H,J=7.3))證實(shí)產(chǎn)物為BHNA,進(jìn)一步證明了我們的推斷是正確的。在整個(gè)作用過程中,邁克爾加成反應(yīng)速度快,而分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)速度較慢,是速控步驟。對(duì)3種硫醇反應(yīng)的不同在于,分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)所得環(huán)狀中間體化合物穩(wěn)定性不同所致。Cys和探針BHENA作用能形成比較穩(wěn)定的七元環(huán),故反應(yīng)作用時(shí)間短,比率熒光響應(yīng)最強(qiáng)。

圖5 推測(cè)的探針對(duì)生物硫醇的作用機(jī)理

3 結(jié)論

我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一種能用于生物硫醇檢測(cè)的比色比率熒光探針。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該探針可對(duì)RSH進(jìn)行選擇性的檢測(cè),尤其是與Cys相互作用時(shí),比率熒光信號(hào)可增強(qiáng)24倍。在光譜研究的基礎(chǔ)上提出了探針對(duì)生物硫醇的檢測(cè)機(jī)理,即探針與RSH先發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)生成硫醚,之后發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化并釋放熒光團(tuán),達(dá)到檢測(cè)RSH的目的。此外,探針對(duì)Cys的響應(yīng)比Hcy/GSH高是由于探針與Cys的環(huán)化反應(yīng)更快所致。