宗陽 姚衛(wèi)峰 單進軍 汪受傳

摘要 ?目的：探尋清宣止咳顆粒治療兒童新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的活性化合物。方法：借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）檢索清宣止咳顆粒中桑葉、薄荷、苦杏仁、桔梗、白芍、枳殼，陳皮、紫菀、甘草的化學成分和作用靶點。通過UniProt、GeneCards等數(shù)據(jù)庫查詢靶點對應的基因，進而運用Cytoscape 3.7.2構建化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡，通過DAVID進行基因本體（GO）功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，預測其作用機制。結果：化合物-靶點網(wǎng)絡包含141個化合物和相應靶點292個，關鍵靶點涉及PTGS2、ESR1、HSP90AA1、CALM1、AR等。GO功能富集分析得到GO條目339個（ P <0.05），其中生物過程（BP）條目244個，細胞組成（CC）條目33個，分子功能（MF）條目62個。KEGG通路富集篩選得到96條信號通路（ P <0.05），涉及小細胞肺癌、非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路等。分子對接結果顯示槲皮素、山柰酚、木犀草素等核心化合物與新冠病毒的親和力與推薦用藥相似。結論：清宣止咳顆粒中的有效活性成分可能通過作用于PTGS2、HSP90AA1、ESR1等靶點調節(jié)多條信號通路從而抑制新型冠狀病毒肺炎作用。

關鍵詞 ?清宣止咳顆粒;新型冠狀病毒肺炎;網(wǎng)絡藥理學;分子對接;槲皮素;山柰酚;木犀草素

Discussion on the Active Compounds of Qingxuan Zhike Granule in Treatment of Pediatric Coronavirus Disease 2019 Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Method

ZONG Yang1，2，YAO Weifeng3，SHAN Jinjun4，WANG Shouchuan4

（1 Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Suzhou 215009，China; 2 Suzhou Academy of Wumen Medical School，Suzhou 215009，China; 3 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 4 Key Laboratory of Pediatric Respiratory Diseases （TCM），Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To explore the active compounds of Qingxuan Zhike Granule for treatment of pediatric Coronavirus disease 2019 （COVID-19）. Methods： With the help of the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP），the chemical constituents and action targets of mulberry leaf，peppermint，bitter apricot seed，platycodon root，debark peony root，orange fruit，dried tangerine peel，tatarian aster root，liquorice root in Qingxuan Zhike granules were retrieved.The genes corresponding to the target were queried through databases such as UniProt and GeneCards，and then Cytoscape 3.7.2 was used to build a compound-target （gene） network，gene ontology （GO） function enrichment analysis was perform through DAVID，based on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG ） Path enrichment analysis，its mechanism was predicted. Results： The compound-target network contains 141 compounds and 292 corresponding targets.The key targets are PTGS2，ESR1，HSP90AA1，CALM1，AR，etc.GO function enrichment analysis obtained 339 GO entries （ P <0.05），of which 244 were biological process （BP） entries，33 were cell composition （CC） entries，and 62 were molecular function （MF） entries.The KEGG Path enrichment analysis obtained 96 signal pathways （ P <0.05），involving small cell lung cancer，non-small cell lung cancer，and T cell receptor signaling pathways.The molecular docking results showed that the core compounds such as quercetin，Kaempferol，luteolin and the like had similar affinity to the COVID-19 virus as the recommended drugs. Conclusion： The active ingredients in Qingxuan Zhike granules may regulate multiple signaling pathways by acting on targets such as PTGS2，HSP90AA1，and ESR1，thereby inhibiting COVID-19.

Keywords ?Qingxuan Zhike granules; Coronavirus disease 2019; Network pharmacology; Molecular docking ; Quercetin; Kaempferol; Luteolin

中圖分類號：R272.5;R512.99 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.001

2019年底湖北省武漢市出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎疫情。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織總干事譚德塞在瑞士日內瓦宣布，將新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“Coronavirus Disease 2019（COVID-19）”[1]，結構由上?？萍即髮W饒子和/楊海濤課題組測定的新冠病毒3CL水解酶（Mpro）的高分辨率晶體結構（PDB ID：6LU7）。見圖1。COVID-19患者的臨床表現(xiàn)為：以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，鼻塞、流涕等上呼吸道癥狀少見[2]。2020年2月19日，國家衛(wèi)健委發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》，以下簡稱第六版診療方案。針對COVID-19的治療目前尚無特效藥，第六版診療方案中采取了中西醫(yī)結合治療的方案針對于輕、中、重度患者進行了分類治療。中醫(yī)藥作為我國傳統(tǒng)的文化瑰寶，它不僅有著完整的理論體系指導而且在歷朝歷代重大疾病尤其是特殊新疾病中都發(fā)揮著不可替代的作用，如何從中醫(yī)藥寶庫中尋找出治療COVID-19的中藥處方以及活性化合物成為當下中醫(yī)藥科研工作者的當務之急。

針對COVID-19患兒，多個省份（湖南、廣西、河南和遼寧等）出臺了專門的兒童中醫(yī)治療方案，其中清宣止咳顆粒作為中期肺胃熱盛者的推薦用藥。清宣止咳顆粒由桑葉、薄荷、桔梗、白芍等9味中藥組成的復方制劑，具有疏風清熱、宣肺止咳的功效，用于小兒外感風熱咳嗽，證見：咳嗽，咯痰，發(fā)熱或鼻塞，流涕，微惡風寒，咽紅或痛[3]。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的原理闡釋疾病發(fā)展的過程，進一步利用網(wǎng)絡平衡的整體觀來認識藥物與機體相互作用的一門學科，具有“多基因、多靶點”的特點[4]。網(wǎng)絡藥理學強調疾病的發(fā)生發(fā)展是一個長期、復雜的動態(tài)過程，并認為疾病的本質是復雜生物網(wǎng)絡的失衡，亦即網(wǎng)絡中的基因或其產物等多個靶點處于功能失衡狀態(tài)，網(wǎng)絡藥理學開創(chuàng)了一種多靶點與多種疾病間復雜網(wǎng)狀關系的新型模式，在復雜疾病發(fā)病機制及治療靶標的研究方面具有重要的應用價值[5]。分子對接是利用計算機技術研究小分子間配體和受體生物大分子相互作用，預測其結合模式和親和力進而實現(xiàn)基于結構的藥物設計的一種重要的方式[6]。本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學篩選出清宣止咳顆粒作用靶點進行聚類分析，得出清宣止咳顆粒中核心活性化合物，進而運用分析軟件對化合物-靶點進行分子對接以及代謝通路分析等，為后期的深入研究以及新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究實驗材料為數(shù)據(jù)庫和分析軟件，數(shù)據(jù)庫包括中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP[7]（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards[8]（https：//www.genecards.org/），蛋白質靶點數(shù)據(jù)庫Uniprot[9]（https：//www.uniprot.org/）、信號通路分析數(shù)據(jù)庫DAVID[10]（https：//david.ncifcrf.gov/）和蛋白質結構數(shù)據(jù)庫PDB[11]（https：//www.rcsb.org）;分析軟件包括網(wǎng)絡分析工具Cytoscape 3.7.2[12]、化合物結構繪制軟件ChemBio Draw Ultra 14.0、分子對接軟件Auto Dock Vina和分子對接作圖軟件PyMOL。

1.2 清宣止咳顆粒中化學成分收集 借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，以“桑葉”“薄荷”“苦杏仁”“桔?！薄鞍咨帧薄拌讱ぁ薄瓣惼ぁ薄白陷摇薄案什荨睓z索清宣止咳顆粒中的化合物組成和靶點等信息。

1.3 清宣止咳顆粒中活性化合物級靶點的篩選?? ?口服利用度（OB）是藥代動力學研究中的重要參數(shù)，常用于新藥研究中評價口服藥物的成藥性，類藥性（DL）是指化合物與已知藥物的相似性，是化合物能夠成為藥物的評價指標[13-14]。因此，運用TCMSP平臺的OB值和DL值篩選功能，其中OB>30%且DL>0.18，篩選后得到每味藥材的潛在活性成分，并通過ChemOffice軟件繪制其二維結構備用。在此基礎上，得到上述化學成分的相關靶點蛋白，并用Uniport數(shù)據(jù)庫查詢靶標對應的基因名。

1.4 化合物-靶點網(wǎng)絡的構建 運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“成分-靶點”網(wǎng)絡，通過Network Analyzer功能對網(wǎng)絡節(jié)點中心性進行分析，以Degree值為篩選條件，Degree值越高，則該成分與更多的靶點相關，從而分析清宣止咳顆粒中的核心化合物和核心作用靶點。

1.5 核心靶點通路分析 將清宣止咳顆粒核心作用靶點的基因導入DAVID數(shù)據(jù)庫，以 P <0.05進行GO功能及KEGG通路富集分析，得到清宣止咳顆粒活性化合物作用靶點的主要生物功能和通路過程，以及其與新冠肺炎潛在的關聯(lián)關系與作用機制中可能性較大的通路，根據(jù)排序繪制條形圖。

1.6 成分-靶點分子對接 ?先用ChemOffice軟件構建化合物的3D結構保存為*mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)下載新冠病毒的3D結構*PDB格式，運用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、加氫等操作，利用Auto Dock軟件將化合物及靶蛋白格式轉換為*pdbqt格式，最后運行Vina進行對接。

2 結果

2.1 活性化合物和靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索后，符合條件OB≥30%，DL≥0.18的化合物共有199個。其中桑葉中29個，薄荷中10個，苦杏仁中19個，桔梗中7個，白芍中13個，枳殼中5個，陳皮中5個，紫菀中19個，甘草中92個。另外，根據(jù)TCMSP化合物靶點信息，共收錄上述成分的作用靶點292個。清宣止咳顆粒中含有的前40個活性化合物基本信息見表1。

2.2 化合物-靶點網(wǎng)絡分析 通過Cytoscape 3.7.2 Network Analyzer分析得出，化合物-靶點網(wǎng)絡總共包括433個節(jié)點（141個化合物節(jié)點、292個靶點節(jié)點）和2 391條邊。見圖2。經過Degree打分排序可以得出，化合物-靶點網(wǎng)絡中，Degree排名前5位的化合物分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL003896-7-甲氧基-2甲基異黃酮、MOL000392-芒柄花黃素，分別能與150、62、57、43、39個靶點蛋白發(fā)生相互作用。從靶點的角度，Degree排名前5位的是PTGS2、ESR1、HSP90AA1、CALM1、AR，分別能與115、88、87、83、78個化合物發(fā)生相互作用。

2.3 清宣止咳顆粒中交集化合物 由2.2可知清宣止咳顆粒中不同的中藥里面存在相同的化合物的情況，通過在線韋恩圖求得，除了桑葉和薄荷沒有交集化合物之外，其他7味藥之間均存在交集現(xiàn)象，尤 其是甘草，苦杏仁與甘草共有7種化合物。見圖3、表2。

2.4 核心靶點的生物信息學分析結果 根據(jù) P <0.05為篩選條件，DAVID中GO功能富集分析得到GO條目339個，其中生物過程（BP）條目244個，細胞組成（CC）條目33個，分子功能（MF）條目62個。見圖4。

KEGG通路富集篩選得到96條信號通路（ P <0.05），涉及小細胞肺癌、非小細胞肺癌、T細胞受體信號通路等，其中小細胞肺癌通路涉及 PIK3CG-AKT1-CCND1-CASP9-PTGS2-RXRB-BCL2- RELA-RXRA-TP53-NOS2-CDK4-CDK2;非小細胞肺癌通路涉及PIK3CG-AKT1-MAPK1-CCND1-CASP9-RXRB-RXRA-TP53-CDK4;T細胞受體信號通路涉及PIK3CG-AKT1-MAPK1-TNF-MAPK14-RELA-JUN-GSK3B-CDK4。見圖5。

2.5 清宣止咳顆粒中核心活性化合物作用于新冠病毒的分子對接結果分析 一般認為配體與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對接結果顯示清宣止咳顆粒中核心活性化合物與新冠病毒的分子對接親和力均小于-20 kJ/mol，由此表明清宣止咳顆粒中核心活性化合物與新冠病毒有較好的結合活性。見表3、圖6。

3 討論

中醫(yī)認為COVID-19屬于“疫病”范疇，源于感受疫癘之氣[16]。第六版診療方案將COVID-19分為醫(yī)學觀察期、輕型、普通型、重型、危重型和恢復期。治則治法擬為辟穢化濁，以祛邪為第一要義，以分消濕熱、宣暢氣機為主，把住早期、進展期治療是減少危重癥、降低病死率的關鍵[17]。從清宣止咳顆粒的適應證以及處方組成可以看出，清宣止咳顆粒適用于輕中型COVID-19患者的治療。清宣止咳顆粒源自溫病止咳名方“桑菊飲”，組方用藥以輕藥為主，藥精量少、不傷正氣，口感清甜、可增加兒童服藥依從性，更適合小兒肺臟嬌嫩的生理特點，是治療小兒外感風熱咳嗽之良方。既往的實驗研究表明[18]，清宣止咳顆粒對急性支氣管炎模型大鼠的病理損傷有修復和減輕其損傷作用，能增強大鼠細胞內殺菌作用，增加大鼠的白細胞移動指數(shù)，提高白細胞趨向化功能，對氨水刺激小鼠咳嗽具有較強鎮(zhèn)咳作用，增加小鼠氣管酚紅排出量對氣管酚紅排出量。

從網(wǎng)絡藥理學分析結果可知，清宣止咳顆粒中Degree值最高的5個化合物均屬于黃酮類成分，與目前臨床推薦使用的西藥進行對比，清宣止咳顆粒中核心活性化合物與新冠病毒3CL水解酶的結合能較為接近尤其是其單體成分山柰酚和木犀草素，結果與達原飲篩選的結果接近[19]。KEGG分析得出的與肺部最為相關的3條通路中均涉及PIK3CG、AKT1、CCND1和CASP9基因，且均是木犀草素的作用靶點。清宣止咳顆粒中核心活性成分是否通過作用于PIK3CG、AKT1等靶點調節(jié)小細胞肺癌通路、非小細胞肺癌通路和T細胞受體信號通路從起到抗COVID-19的作用需要進一步研究。

綜上所述，本文利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術對清宣止咳顆粒中化學成分、作用靶點和其核心活性化合物以及與新冠病毒結合能進行了探索性研究，從中可以看出清宣止咳顆粒治療COVID-19是可以通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用來發(fā)揮療效的。

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（2020-02-24收稿 責任編輯：王明）

基金項目：國家自然科學基金項目（81973445，81573554）;江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項目（YY026）;蘇州市“科教興衛(wèi)”青年課題（KJXW2019044）;蘇州市科技局指導性課題（SYSD2019149）;蘇州市中醫(yī)醫(yī)院院級科技計劃項目（YQN2017004）作者簡介：宗陽（1991.07—），男，碩士，中藥師，研究方向：中藥藥效物質基礎研究，E-mail：1181835152@qq.com通信作者：姚衛(wèi)峰（1979.12—），男，博士，教授，碩士研究生導師，研究方向：中藥藥效物質基礎研究，E-mail：yaowf@njucm.edu.cn