田海嬌，張府君，武 婷

(1 山西省分析科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2 山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系，山西 太原 030031)

甲硝唑和地美硝唑作為硝基咪唑類藥物具有抗原蟲和抗厭氧菌活性[1]，主要用于預(yù)防、治療滴蟲、原蟲病和厭氧菌引起的感染[2]。很多養(yǎng)殖戶對(duì)該類藥物的毒副作用了解不充分,常在動(dòng)物飼養(yǎng)中造成藥劑量偏高，但同時(shí)也帶來了藥物殘留問題[3]，間接危害人體健康。體內(nèi)外毒理試驗(yàn)證實(shí)，硝基咪唑類藥物具有致畸[4]、致突變[5]、致癌[6]作用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定甲硝唑和地美硝唑允許用作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出[7]。歐盟在96/23/EC歐盟理事會(huì)指令及EC2377/90[8]中將甲硝唑和地美硝唑列入A類禁用藥。因此，對(duì)飼料級(jí)獸藥中這類物質(zhì)的含量監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。

硝基咪唑類藥物化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解，因此對(duì)這類物質(zhì)的檢測(cè)比較困難。目前檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]、液相色譜法[11]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]。氣相法和氣質(zhì)法的缺點(diǎn)是需要衍生化，液相法的選擇性和靈敏度較差。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料級(jí)獸藥中的甲硝唑和地美硝咪唑，該方法具有快速高效、高靈敏度等特點(diǎn)，為從源頭上對(duì)飼料級(jí)獸藥的監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(ACQUITY Ultra Performance LCTM)，美國(guó)Waters公司；渦旋混合器(TALBOYS Advanced Vortex Mixer)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；AL104電子分析天平，德國(guó)Mettler-Toledo公司；Ultra turrax IKA T18超聲波，德國(guó)IKA公司。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；超純水(電阻率為18.2 MΩ*cm)。甲硝唑、地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度為95%)，國(guó)家生物制品所。分別準(zhǔn)確稱取甲硝唑和地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇溶解并準(zhǔn)確定容到10 mL配制成濃度為1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并置于在-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)多種提取方法進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)采用超聲萃取法，操作簡(jiǎn)單，高效。準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品，加入4 mL 無水乙醇后超聲10 min后，用0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶，待上機(jī)分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min；采用梯度洗脫程序：0 min→ 3 min，10%A→90%A；3 min→ 3.1 min，90%A→ 10%A；3.1 min→ 4 min，10%A。

1.2.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離(ESI)正離子掃描；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃；脫溶劑氣流采用氮?dú)?流速700 L/hr)；錐孔氣流采用氮?dú)?流速50 L/hr)；毛細(xì)管電壓3.0 kV；碰撞氣為氬氣，碰撞氣壓3.50×10-4MPa；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。MRM條件見表1。

表1 離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量

2 結(jié) 果

2.1 線性范圍

根據(jù)樣品溶液中這兩種物質(zhì)的含量，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用甲醇將混標(biāo)儲(chǔ)備溶液稀釋至濃度分別為0.00、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為Y軸與對(duì)相應(yīng)的濃度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出相關(guān)系數(shù)均大于0.9980，表明甲硝唑和地美硝唑溶液的濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以信噪比(S/N)≥10計(jì)算，甲硝唑和地美硝唑兩種物質(zhì)的定量限均為0.1 mg/kg。

2.2 回收率與精密度

參考標(biāo)準(zhǔn)SN/T0001中對(duì)于禁用物質(zhì)或未設(shè)定容許限的物質(zhì)進(jìn)行回收率試驗(yàn)一般選擇LOQ、2LOQ、10LOQ作為添加濃度水平的規(guī)定，以及本試驗(yàn)檢測(cè)樣品中甲硝唑和地美硝唑的含量較低，故采用空白樣品基質(zhì)進(jìn)行濃度水平為0.2、0.5、1.0 mg/L的添加回收試驗(yàn)，測(cè)得甲硝唑和地美硝唑在三個(gè)添加水平下的的回收率(±RSD)分別為88.6%±5.1%，91.4%±8.0%，95.4%±3.6%和89.3%±7.4%，90.9%±5.8%，95.8%±5.7%。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相是影響待測(cè)物質(zhì)分離效果和保留時(shí)間的重要因素。《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版中是選用基礎(chǔ)溶劑組合甲醇-水作為流動(dòng)相，結(jié)果色譜峰拖尾嚴(yán)重，分離度及柱效較低。鑒于地美硝唑具有弱堿性，考慮在流動(dòng)相中使用偏酸性的緩沖液，這樣可以改善峰形，防止拖尾，分離效果較好[15]。由于乙腈對(duì)目標(biāo)物溶解性較高[3]，因此本方法采用了乙腈-1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.2 儀器條件的優(yōu)化

在正離子模式下，選擇甲硝唑和地美硝唑的最佳分子離子峰以及其錐孔電壓，然后再對(duì)一對(duì)碎片進(jìn)行選擇及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化得出優(yōu)化后儀器條件下的色譜圖。圖1為甲硝唑和地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

圖1 甲硝唑(a)和地美硝唑(b)0.1 mg/kg多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

4 結(jié) 論

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀技術(shù)手段建立了測(cè)定飼料級(jí)獸藥制劑中甲硝唑和地美硝唑的最優(yōu)檢測(cè)方法，該法具有檢測(cè)限低、回收率高、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，減少時(shí)間和材料的能耗，為檢測(cè)甲硝唑和地美硝唑的含量提供了有效的技術(shù)支持和幫助。