馮春特, 黃伊嘉, 楊磊*, 莫開(kāi)林*

1. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；

2. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081

夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科夏枯草屬植物，是一種重要的多年生藥用植物，在全國(guó)各地均有分布，主產(chǎn)于四川、陜西、甘肅、江蘇、浙江、安徽、河南等省，國(guó)外主要分布在歐洲、北非、西亞、印度、北美洲等地[1]。夏枯草作為一種傳統(tǒng)的中藥，在中國(guó)有多年的使用歷史。傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為夏枯草味道苦澀而且辣性冷，具有消腫、抗發(fā)熱和鎮(zhèn)靜的作用[2,3]?，F(xiàn)代臨床研究表明，夏枯草具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抗病毒、抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性[4-7]。除藥用外，夏枯草也被應(yīng)用于涼茶和食品中[8]。

研究表明，夏枯草中含有多種類(lèi)型的化學(xué)成分，目前從中已分離出萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油及糖類(lèi)等多種化學(xué)成分[9]。迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（Rosmarinic acid-3-O-glucoside）作為夏枯草的特征成分[10,11]，已被人們廣泛研究。藥理學(xué)研究表明，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷都具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等[12-14]。

超聲細(xì)胞破碎輔助提取是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，擁有操作簡(jiǎn)單，提取時(shí)間短和溶劑消耗少的特點(diǎn)，已經(jīng)成功應(yīng)用于很多中藥植物活性成分的提取[15]。本實(shí)驗(yàn)將超聲探頭直接接觸植物組織與提取溶劑，對(duì)夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的提取工藝進(jìn)行研究，為中藥夏枯草資源的深度開(kāi)發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

夏枯草購(gòu)于安徽亳州市大西北藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)谷會(huì)巖教授鑒定，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60～80 目備用。

迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（純度98%，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色譜級(jí)，賽莫非世爾科技(中國(guó))有限公司），乙醇（分析級(jí)，天津市天士力化學(xué)試劑有限公司）。

高效液相色譜儀（安捷倫Agilent 1260），超聲波細(xì)胞破碎儀（型號(hào)JY92-IID）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷進(jìn)行HPLC 定量分析，色譜條件為：Agilent 5 TC-C18 色譜柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)315 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速為1 mL·min-1；流動(dòng)相體系為0.2 %磷酸-甲醇（60∶40），等度洗脫30 min。

按照上述色譜條件，配制系列濃度（0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、 0.3 mg·mL-1、 0.4 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1）的迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品溶液，HPLC 檢測(cè)，線性擬合得到回歸方程分別為：

式中: x 為對(duì)照品的濃度(mg·mL-1)，Y 為峰面積

1.2.2 樣品中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷含量測(cè)定

稱(chēng)取夏枯草粉末0.5g，于10 mL 50%乙醇中超聲提取10 min。過(guò)濾得粗提液。取粗提液2 mL 過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，HPLC 檢測(cè)得目標(biāo)產(chǎn)物峰面積，代入回歸方程得到產(chǎn)物濃度。產(chǎn)物得率計(jì)算公式為：

式中：Y 為產(chǎn) 物 的 率（mg·g-1）；c 為粗提 液 濃 度（mg·mL-1）；v 粗提液為體積（mL）；m 為夏枯草粉末質(zhì)量（g）

1.2.3 超聲輔助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷

根據(jù)迷迭香酸類(lèi)物質(zhì)的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)選取乙醇作為提取溶劑[16]。精確稱(chēng)取夏枯草粉末0.5 g 于容器中，在不同條件下進(jìn)行超聲輔助提取，計(jì)算得率。分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、空化時(shí)間、緩沖時(shí)間、超聲功率和提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物得率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取夏枯草粉末0.5 g，分別加入10 mL 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（0、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %和80 %），空化時(shí)間1.5 s，緩沖時(shí)間2.0 s，超聲功率250 W，在此條件下超聲提取10 min。取濾液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，HPLC 檢測(cè)，計(jì)算得率。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影響如圖1 所示，由圖可見(jiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，目標(biāo)產(chǎn)物迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率增長(zhǎng)顯著，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超50%時(shí)，產(chǎn)物的得率有下降趨勢(shì)，綜合考慮，選取體積分?jǐn)?shù)50 %的乙醇作為最佳濃度。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on yield

2.2 液料比的影響

選用50%的乙醇作為提取溶劑，選用不同的液料比（10、15、20、25 和30 mL·g-1），在250 W 功率下，空化1.5 s，緩沖2.0 s，超聲提取10 min。圖2顯示了不同液料比對(duì)產(chǎn)物得率的影響。由圖可知，隨著液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率呈遞增趨勢(shì)，這是由于溶劑用量的增加，物料與溶劑的接觸面積增加，有利于目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)散速度的提高。當(dāng)液料比在增長(zhǎng)到25 mL·g-1時(shí)，隨著液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率變化不明顯，因此考慮不造成溶劑的浪費(fèi)，我們選擇25 mL·g-1作為最佳液料比。

圖2 液料比的影響Fig. 2 Effect of liquid-solid ratio on yield

2.3 超聲時(shí)間的影響

選用50%的乙醇，25 mL·g-1的液料比，在250 W功率下考察不同超聲時(shí)間（1、3、5、7、9 和11 min）對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果如圖3 所示，7 min 之后隨著時(shí)間的增加，目標(biāo)產(chǎn)物得率變化不顯著，推測(cè)可能是由于超聲探頭直接與提取溶劑與物料接觸，能夠更充分地破壞細(xì)胞壁使目標(biāo)產(chǎn)物釋放，使其在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到提取完全，因此為避免造成資源的浪費(fèi)，我們選取提取時(shí)間7 min 作為最佳的超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic irradiation time on yield

2.4 超聲功率的影響

提取溶劑為50%的乙醇，液料比為25 mL·g-1，在不同的超聲功率（150 W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W 和500 W）條件下空化1.5 s，緩沖2.0 s，提取7 min。目標(biāo)產(chǎn)物得率隨功率變化的趨勢(shì)如圖4 所示，功率由150 W 增加到300 W 時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的得率有增加趨勢(shì)，300 W 之后隨著功率的增加，產(chǎn)物得率變化不顯著，推測(cè)可能是超聲探頭直接接觸物料，避免了超聲波在傳輸過(guò)程中能量的損耗，所以較低的功率就能夠充分破壞細(xì)胞壁，因此將300 W 作為最佳的超聲功率。

2.5 空化時(shí)間和緩沖時(shí)間的影響

在超聲功率300 W，超聲時(shí)間7 min，液料比25 mL·g-1，提取溶劑選用50%乙醇條件下，分別考察不同空化時(shí)間（0.5～3.5 s）、不同緩沖時(shí)間（0.5～3.5 s）對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物得率的影響。不同空化時(shí)間對(duì)產(chǎn)物得率的影響如圖5 所示，0.5 s 至1.5 s 目標(biāo)產(chǎn)物得率有增加趨勢(shì)，1.5 s 之后，隨著空化時(shí)間的增加，目標(biāo)產(chǎn)物的得率變化不顯著，考慮到能耗的因素，因此我們選擇空化時(shí)間1.5 s 作為最佳條件。

圖4 超聲功率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic irradiation power on yield

圖5 空化時(shí)間的影響Fig. 5 Effect of cavitation time on yield

圖6 顯示了不同緩沖時(shí)間對(duì)迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影響。如圖所示，緩沖時(shí)間在0.5～2.0 s時(shí)間范圍內(nèi)，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率有增加趨勢(shì)，2.0 s 之后，隨著緩沖時(shí)間的增加，目標(biāo)產(chǎn)物的得率有降低趨勢(shì)，推測(cè)可能是隨著緩沖時(shí)間增加，同一提取過(guò)程中空化時(shí)間減少，降低了目標(biāo)產(chǎn)物向溶劑的擴(kuò)散，從而導(dǎo)致得率的降低。因此，我們選擇2.0 s 作為最佳緩沖時(shí)間。

圖6 緩沖時(shí)間的影響Fig. 6 Effect of buffer time on yield

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為提取劑，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到超聲細(xì)胞破碎輔助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比25 mL·g-1，空化時(shí)間1.5 s，緩沖時(shí)間2.0 s，超聲功率300 W，提取時(shí)間7 min，在最佳條件下迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率為0.71 mg·g-1。超聲細(xì)胞破碎輔助提取在常溫下就可進(jìn)行，具有提取效率高、時(shí)間短、綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。