陳若，張紅雁

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院腫瘤放療科，安徽 合肥)

0 引言

直腸癌是我國常見的消化道腫瘤之一，在全球所有惡性腫瘤發(fā)病率中位于第3位，死亡率高居第4位[1,2]，且我國發(fā)病率以及死亡率逐年都有上升的趨勢[3]。隨著對疾病了解的日益深刻，直腸癌治療全程化的管理越來越趨向精細化、個性化。因此，如何利用多學科綜合治療的優(yōu)勢來提高直腸癌患者生存率和生活質(zhì)量、降低直腸癌的復發(fā)率，成為我國直腸癌臨床研究中亟待解決的問題之一。

本研究通過觀察直腸癌患者治療前后營養(yǎng)風險篩查、營養(yǎng)狀況，并通過流式細胞技術檢測直腸癌患者圍放療期外周血CD4+T細胞、Treg細胞及CD4+/CD8+的變化情況，探索是否可以有基于血液的免疫相關生物標記物具有預測新輔助放化療早期反應的可能，并同時可以預測患者預后生存情況。

1 資料和方法

1.1 病例的選擇

選擇安徽省立醫(yī)院腫瘤放療科2018年1月至2019年10月54例接受盆腔精確放射治療的原發(fā)直腸腺癌患者。

1.2 入組標準

(1)病理為直腸腺癌的患者；(2)無嚴重心、肝、腎功能不全，無活動性全身感染，且無嚴重的消化系統(tǒng)疾病、營養(yǎng)代謝疾病和內(nèi)分泌疾病病史；(3)未同時接受免疫治療的患者；(4)無其他腫瘤以及放療前CT、MRI等各項影像學檢查提示未見遠處器官轉(zhuǎn)移；(5)按照術前(已行手術患者)或放療前(未行手術患者)定位掃描時MRI分期，選擇TNM分期為II-III期的患者；(6)自愿參加并簽署知情同意書。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(倫理批件號：2019KY倫審第101號)。

1.3 排除標準

(1)有遠處轉(zhuǎn)移的患者；(2)曾合并其他惡性腫瘤的患者；(3)同時接受慢性系統(tǒng)性免疫治療的患者；(4)患者依從性差，不能配合完成本研究的信息采集。

1.4 治療方案

1.4.1 方案推薦

局部進展期直腸癌患者現(xiàn)推薦行“新輔助放化療+手術”或“手術+輔助放化療”，采用 6Mv-X線IMRT(intensity-modulated radiation therapy ，適形調(diào)強放療)治療，給予全盆腔照射，主要劑量分割方式為25 Gy/5f/1周和50 Gy/25f/5周。

1.4.2 靶區(qū)勾畫

(1)術 前 靶 區(qū) 定 義：GTVnd(lymph node gross tumor volume，陽性淋巴結大體腫瘤體積)包含直腸MRI/盆腔CT顯示的直腸系膜區(qū)、骶前區(qū)、髂總、髂內(nèi)、閉孔以及髂外大于1cm的轉(zhuǎn)移淋巴結和癌結節(jié)。CTVp(primary tumor CTV，原發(fā)腫瘤臨床靶體積)特指原發(fā)灶的臨床靶區(qū)，包括原發(fā)灶頭腳方向外擴2cm的范圍。CTV(clinical target volume，臨床靶體積)為包括高危淋巴結引流區(qū)，部分髂總、髂內(nèi)、髂外(下界到股骨頭出現(xiàn)水平)、閉孔、骶前、直腸系膜區(qū)以及腹股溝淋巴引流區(qū)(視病人具體情況確定是否包括)，PTV(plan target volume，計劃靶體積)在CTVp和CTV基礎上前后左右外放0.5-0.7cm。(2)術后靶區(qū)定義：包括瘤床、吻合口或會陰瘢痕、術后高危淋巴結引流區(qū)及高危復發(fā)區(qū)，部分髂總、髂內(nèi)、髂外(下界到股骨頭出現(xiàn)水平)、閉孔、骶前、直腸系膜區(qū)以及腹股溝淋巴引流區(qū)，PTV在CTV基礎上前后左右外放0.5-0.7cm。正常組織限量：膀胱V50＜50%，小腸V50＜10%、最大劑量小于52Gy，股骨頭V50＜5%。

1.4.3 具體方案

本研究根據(jù)患者個體化情況，治療方案分為3種：(1)術前短程大分割放療(放療后7-10天行手術)(2)術前常規(guī)分割放療同步化療(放療后4-6周行手術)(3)術后常規(guī)分割放療同步化療(具體手術方式由外科醫(yī)師決定，術后4周至6周行放療)。同步化療方案為卡培他濱(正大天晴/羅氏)化療(卡培他濱劑量根據(jù)患者體表面積計算，用量為825mg/m2，一日兩次，每周第一天至第五天服用)。

1.5 檢測方法

于研究對象實施第一次放療前一天、放療計劃結束后一天及放療結束后一月抽取患者靜脈血2mL，行血常規(guī)以及生活檢測，并采用流式細胞術檢測患者外周血T細胞亞群的占比 ，采用三激光10色法，檢測患者血清CD4+T細胞占淋巴細胞百分比、Treg細胞占CD4+T細胞百分比以及CD4+/CD8+比值。

1.6 營養(yǎng)風險篩查

NRS2002評分1分：可通過口服來補充蛋白質(zhì)需要量；NRS2002評分2分：患者需臥床，需要一定的腸外或腸內(nèi)營養(yǎng)支持；NRS2002評分3分：通過腸外或腸內(nèi)營養(yǎng)支持，可使患者機體內(nèi)蛋白質(zhì)分解和氮丟失明顯減少?？偡种怠?分，予以患者飲食指導。

1.7 隨訪

患者放射治療后1月門診或住院隨訪，記錄體重數(shù)據(jù)，采集血常規(guī)、T細胞亞群、腫瘤標志物等血液學指標等，評估患者遠期療效包括局部控制率、無病生存率、無遠處轉(zhuǎn)移率及總生存率。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0進行本研究資料分析。主要數(shù)據(jù)為多時點觀測計量資料，以均值±SD描述，組間比較為單因素重復測量方差分析+組內(nèi)各時點間兩兩比較差值t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 數(shù)據(jù)和結果

2.1 基本資料

54例直腸癌患者資料列于表1。其中，男性35例，女性19例；年齡為27-87歲，中位年齡為55歲，平均年齡為55.96歲；病理為高分化腺癌8例，中分化腺癌33例，低分化腺癌13例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制訂的第8版TNM分期標準Ⅱ期14例，Ⅲ期40例。術前短程快速大分割放療9例，術前常規(guī)分割放療17例，術后常規(guī)分割放療28例。

2.2 結果

詳細數(shù)據(jù)匯總及比較見表2。分別為：

2.2.1 外周血免疫功能指標變化

外周血CD4+T細胞絕對值、Treg細胞絕對值放療結束時較放療開始時下降，放療結束后一月較放療結束時絕對值升高具有統(tǒng)計學意義?；颊咄庵苎狢D4+/CD8+比值放療結束時較放療開始時升高，放療結束后1月較放療結束時絕對值下降，結果具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2.2 按照放療結束后營養(yǎng)狀況分組

將前白蛋白放療結束后比放療開始時降低10%歸為前白蛋白下降組，余下患者歸為前白蛋白未下降組對比。其中，對于Treg細胞絕對值，前白蛋白下降組放療開始至結束較未下降組低，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值統(tǒng)計學無明顯差異(P＞0.05)。

2.2.3 按照放療結束后腫瘤標志物分組

將CEA或CA199放療結束后比放療開始時升高并超過正常值的患者歸為CEA升高組或CA199升高組，余下患者歸為CEA無升高組或CA199無升高組。其中，對于CD4+/CD8+比值，CEA升高組或CA199升高組放療開始至結束一直呈下降趨勢，CEA無升高組或CA199無升高組放療結束時較開始時升高，放療結束后開始下降。

表1 納入研究患者基本特征

3 討論

直腸癌是一種嚴重威脅人類健康、影響生活質(zhì)量的消化道惡性腫瘤，放射治療在直腸癌治療中起著重要的作用，但局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍是需要解決的問題之一[4,5]。近年來，直腸癌治療領域除了放療、手術、化療、靶向治療和免疫治療，已成為一個新的研究熱點[6]。本研究選擇局部進展期直腸癌患者，采集患者放化療期間外周血，通過觀察、了解患者放射治療模式下免疫細胞的變化情況，尋找能在直腸癌治療中預測預后的特異性指標。

腫瘤微環(huán)境是由炎癥微環(huán)境、免疫微環(huán)境、血管生成微環(huán)境等共同構成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[7]。有研究[8]將消化道惡性腫瘤患者與健康人外周血T淋巴細胞亞群表達水平比較后提出，惡性腫瘤患者體內(nèi)會出現(xiàn)免疫紊亂，免疫系統(tǒng)功能較正?；颊叩拖?。而Treg細胞作為一類負調(diào)節(jié)免疫應答的淋巴細胞，通過發(fā)揮免疫抑制功能，參與維持自身免疫耐受和避免過量免疫應答等過程[9]，是機體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要機制之一。有研究[10]通過測定細胞程序性死亡-配體1和Treg細胞在結直腸癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)Treg細胞高浸潤的患者2年無進展生存期高于Treg細胞低浸潤的患者。本研究中直腸癌患者CD4+T細胞絕對值及Treg細胞絕對值于放療結束后到結束后一月時免疫功能有一定回升的趨勢，一定程度提示放療影響了細胞免疫，且Treg細胞高浸潤對患者預后的改善有一定價值。Treg細胞產(chǎn)生的外泌體可調(diào)控腫瘤細胞以及腫瘤的微環(huán)境，引起腫瘤免疫逃逸，影響腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]，如將Treg細胞來源的外泌體作為治療的手段，后續(xù)研究可以根據(jù)檢測Treg細胞數(shù)目來設計這些新型治療方案加入放療方案的時間點。前白蛋白和白蛋白都是目前臨床上用于評估患者營養(yǎng)狀態(tài)的指標[12]，本研究中營養(yǎng)狀態(tài)較差的局部進展期直腸腺癌患者放療期間以及放療結束后外周血Treg細胞絕對值低于營養(yǎng)狀態(tài)較好的直腸癌患者，表明免疫系統(tǒng)越活躍的患者在接受放療和對抗腫瘤的過程中營養(yǎng)狀況影響越小，預后更佳。營養(yǎng)不良可能降低腫瘤對放化療治療的敏感性，使免疫系統(tǒng)反應降低，而造成對患者療效及預后的不利影響。

表2 患者放療前后免疫指標變化

表2 患者放療前后免疫指標變化

注：顯著性標記a、b分別為和放療前、放療結束時比較P＜0.05；顯著性標記*為P＜0.05組間有統(tǒng)計學差異

CD4+T細胞絕對值(1010/L)Treg細胞絕對值(1011/L)CD4+/CD8+比值放療前 5.96±0.40 3.34±0.36 1.90±0.19放療結束時 2.60±0.30a 1.36±0.15a 2.51±0.23a放療結束后1月 3.74±0.55a.b 4.27±0.40b 1.45±0.16b P值 0.000* 0.000* 0.000*是否出現(xiàn)進展分組 0.696 0.108 0.371 CEA是否升高 0.560 0.278 0.001*CA199是否升高 0.932 0.187 0.002*NRS是否上升 0.083 0.170 0.093白蛋白是否下降 0.645 0.840 0.352前白蛋白是否下降 0.381 0.043* 0.307

直腸癌是消化道惡性腫瘤中預后相對較好的一類疾病。有回顧性研究[13]分析了264例直腸癌患者接受治療后的生存時間，最長者為75個月，3年和5年生存率分別為75.43%、51.69%。本研究中局部進展期直腸癌患者最短隨訪時間為治療結束后4月，最長為23月，截止至2020年1月，僅有4例患者出現(xiàn)病情進展，與無進展組對比數(shù)據(jù)暫無明顯差異。由于研究未有充足時間隨訪分析患者治療后3-5年的生存情況，現(xiàn)臨床上多應用CEA、CA199來輔助判斷患者的預后以及提示患者可能出現(xiàn)的進展[14]。根據(jù)患者治療前后CEA、CA199腫瘤學指標的變化分組，發(fā)現(xiàn)腫瘤指標無升高組在放射治療進行時CD4+/CD8+比值有上升趨勢，待放療結束后緩慢下降；但是腫瘤指標升高組治療期間CD4+/CD8+比值無升高趨勢，呈一直下降的趨勢至腫瘤放射治療后1月，表明了CD4+/CD8+比值放射治療期間無上升的直腸癌患者預后優(yōu)于CD4+/CD8+比值放射治療期間一直下降的患者。當CD4+/CD8+比值下降時，提示機體的免疫狀態(tài)出現(xiàn)紊亂，抗腫瘤能力下降，也一定程度上表明了免疫細胞功能較強的直腸癌患者放射治療后預后更佳。

目前，國內(nèi)缺乏針對直腸癌開展的前瞻性觀察性研究，本研究動態(tài)記錄直腸癌患者自放療開始至放療結束后隨訪數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)局部進展期直腸癌患者外周血放療前與放療結束時、放療前與放療結束后1月CD4+T細胞及Treg細胞絕對值一定程度上提示放療調(diào)動了細胞免疫；放射治療中以及放療結束后CD4+/CD8+比值偏低一定程度上預示著預后不良，且免疫功能越活躍的患者在接受放療和對抗腫瘤的過程中營養(yǎng)狀況受影響小，預后更佳。T細胞亞群檢測作為非侵入型手段，目的是篩選高獲益人群，提高治療的個體化以及精準化，預測療效性預后。