姚 銳， 任學(xué)軍， 李明昊， 楊夢(mèng)涵， 郭振清， 高 慧， 林小虎

(河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院， 河北 秦皇島 066004)

麥類作物作為禾本科作物中基因組多倍化較為復(fù)雜的一個(gè)類群，它們?cè)诙啾缎赃M(jìn)化過程中極易發(fā)生染色體重排，廣泛的染色體重排增加了基因組的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致了新核型和子代新物種的形成[1]。隨著“中國(guó)春”小麥基因組測(cè)序完成及其近緣物種(粗山羊草、二穗短柄草等)基因組草圖的公布，利用比較基因組學(xué)方法研究小麥基因組序列組裝、染色體結(jié)構(gòu)變異受到許多學(xué)者的關(guān)注。馬建等[2]鑒定了“中國(guó)春”小麥4 A、5 A 和7 B易位染色體上參與易位和倒位片段的斷點(diǎn)側(cè)翼基因序列；Wang等[3]揭示了小麥、大麥、粗山羊草和短柄草基因組獨(dú)立的重組關(guān)系；孫桑蓉[4]明確了全基因組加倍對(duì)于麥類基因家族擴(kuò)增有著重要作用，并通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行了基因組結(jié)構(gòu)解析和多倍化過程的重構(gòu)。麥類作物基因組草圖測(cè)序工作的完成為闡明麥類作物基因組的多倍性進(jìn)化歷程起到推動(dòng)作用，但染色體核型分析在近緣多倍性物種進(jìn)化關(guān)系分析中依然具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[5-6]。

黑麥屬(SecaleL.)是小麥的三級(jí)基因源，具有抗白粉病、抗三銹病、抗旱、抗寒等優(yōu)良性狀[7-8]。為了將黑麥中的有益基因轉(zhuǎn)移到小麥中，育種家利用遠(yuǎn)緣雜交等手段創(chuàng)制了一批小麥-黑麥雙二倍體、非整倍體。其中六倍體小黑麥和八倍體小黑麥作為創(chuàng)造小麥-黑麥異附加系、異代換系、異易位系的重要材料，在育種工作中具有重要地位[9]。六倍體小黑麥(AABBRR,2 n=42)由四倍體小麥(T.turgidum, AABB,2 n=28)或普通小麥(TriticumaetivumL. AABBDD,2 n=42)和二倍體黑麥(SecalecerealL. RR,2 n=14)遠(yuǎn)緣雜交、人工染色體加倍獲得，八倍體小黑麥(AABBDDRR,2 n=56)是由普通小麥(TriticumaetivumL. AABBDD,2 n=42)和二倍體黑麥遠(yuǎn)緣雜交、人工染色體加倍獲得。關(guān)于二倍體黑麥和六倍體小黑麥的核型已有相關(guān)報(bào)道，普遍認(rèn)為二倍體黑麥有14條染色體，但不同品種及生境的二倍體黑麥染色體核型類型不盡相同[10-12]；六倍體小黑麥有42條染色體，武晶研究得出的核型分析結(jié)果為2 n=42=30 m(2 SAT)+2 M+8 sm+2 st(2 SAT)[13]，然而尚未見八倍體小黑麥的核型報(bào)道。本研究首次報(bào)道了八倍體小黑麥的核型，豐富了小黑麥的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，并且將八倍體小黑麥與二倍體黑麥、六倍體小黑麥的核型進(jìn)行了進(jìn)化趨勢(shì)分析，旨在為3個(gè)物種的染色體組學(xué)研究和相關(guān)的麥類作物育種提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料二倍體黑麥(SecalecerealL.)為荊州黑麥；六倍體小黑麥(×TriticalehexaploideL.)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)自墨西哥國(guó)際玉米小麥改良中心引進(jìn)；八倍體小黑麥(×TriticaleoctoploidL.)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)亓增軍教授以荊州黑麥和普通小麥輝縣紅創(chuàng)制，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)。上述材料均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院國(guó)家小麥改良中心泰安分中心王洪剛教授課題組提供。

1.2 方 法

1.2.1實(shí)驗(yàn)方法

將3種供試材料種子置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中室溫浸種至露白，移置于濕潤(rùn)的濾紙上室溫培養(yǎng)，待根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，剪取根尖放入EP管中，冰水浴36 h。用卡諾固定液(乙醇∶冰醋酸體積比3∶1)固定2 d。蒸餾水漂洗后于1 mol·L-1HCl溶液中60 ℃解離8 min，蒸餾水漂洗10 min，改良卡寶品紅染液染色2 min，壓片并在OLYMPUS BX 53型顯微鏡下鏡檢，統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞染色體數(shù)目，選取染色體分散良好的細(xì)胞拍照。采用Photoshop CS 6軟件分析圖像[14]，并用Excel軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.2染色體核型分析方法及進(jìn)化指數(shù)賦值方法

每個(gè)物種選取5個(gè)染色體處于有絲分裂中期且分散良好的細(xì)胞，參照李懋學(xué)等[15]的染色體核型方法計(jì)算核型數(shù)值。核型類型參照Stebbins[16]的標(biāo)準(zhǔn)。核型不對(duì)稱系數(shù)參照Arano[17]的方法計(jì)算。染色體相對(duì)長(zhǎng)度比、平均臂比、不對(duì)稱系數(shù)、臂比大于1.7的染色體比例采用分支系統(tǒng)學(xué)的常規(guī)編序、賦值方法進(jìn)行賦值[18]，最終求得可以反映每個(gè)物種進(jìn)化程度的進(jìn)化指數(shù)。具體賦值方法如下：

1) 染色體長(zhǎng)度比越大，核型越傾向于不對(duì)稱。3個(gè)物種的染色體長(zhǎng)度比可粗略分為4個(gè)進(jìn)化階段，即1.00以下(賦值為0)→1.00～1.50(賦值為1)→1.51～2.00(賦值為2)→2.01及以上(賦值為3)。

2) 平均臂比值越大，核型越顯不對(duì)稱。3個(gè)物種的染色體平均臂比值分為4個(gè)階段，即1.70以下(賦值為0)→1.70～1.90(賦值為1)→1.91～2.10(賦值為2)→2.11及以上(賦值為3)。

3) 臂比大于1.7的染色體比例越大，核型越顯不對(duì)稱。3個(gè)物種的染色體臂比大于1.7的染色體比例分為4個(gè)進(jìn)化階段，即0.20及以下(賦值為0)→0.21～0.40(賦值為1)→0.41～0.60(賦值為2)→0.61及以上(賦值為3)。

4) 不對(duì)稱系數(shù)偏大，核型也顯示不對(duì)稱。3個(gè)物種染色體不對(duì)稱系數(shù)分為4個(gè)進(jìn)化階段，即60以下(賦值為0)→60～62(賦值為1)→62～64(賦值為2)→64以上(賦值為3)。

注：A為二倍體黑麥染色體形態(tài)；B為六倍體小黑麥染色體形態(tài)；C為八倍體小黑麥染色體形態(tài)；D為二倍體黑麥染色體核型；E為六倍體小黑麥染色體核型；F為八倍體小黑麥染色體核型。標(biāo)尺200 μm。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)共測(cè)量分析麥類作物含R基因組3個(gè)物種的核型，根尖細(xì)胞染色體形態(tài)、核型見圖1，染色體核型參數(shù)及進(jìn)化指數(shù)見表1和表2。

二倍體黑麥染色體相對(duì)長(zhǎng)度范圍為10.36%～16.92%，最長(zhǎng)和最短的染色體比值為1.63，臂比大于2∶1的染色體為0對(duì)，應(yīng)屬于“1 A”型。核型不對(duì)稱系數(shù)為58.08%，屬于較為對(duì)稱類型。第3、6對(duì)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體，其余為中間著絲點(diǎn)染色體，1染色體帶有隨體，其核型公式為2 n=2 x=14=10 m+4 sm+(2 SAT)(表1)。

六倍體小黑麥染色體相對(duì)長(zhǎng)度范圍為3.50%～6.02%，最長(zhǎng)和最短的染色體比值為1.72，臂比大于2∶1的染色體為2對(duì)，應(yīng)屬于“2 A”型。核型不對(duì)稱系數(shù)為57.91%，屬于較為對(duì)稱類型。第12對(duì)為正中部著絲點(diǎn)染色體，第3、11、15對(duì)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體，其余為中部著絲點(diǎn)染色體，其核型公式為2 n=6 x=42=2 M+34 m+6 sm(表1)。

八倍體小黑麥染色體相對(duì)長(zhǎng)度范圍為2.45%～4.62%，最長(zhǎng)和最短的染色體比值為1.89，臂比大于2∶1的染色體為1對(duì)，應(yīng)屬于“2 A”型。核型不對(duì)稱系數(shù)為56.44%，屬于較為對(duì)稱類型。第15、23、25對(duì)染色體為正中部著絲點(diǎn)染色體，第14、24、26對(duì)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體，其余為中部著絲點(diǎn)染色體，其核型公式為2 n=8 x=56=6 M+44 m+6 sm(表1)。

依據(jù)Stebbins提出的核型進(jìn)化理論，核型進(jìn)化是由對(duì)稱向不對(duì)稱方向發(fā)展的[13]。核型參數(shù)可以反映每個(gè)物種發(fā)育的進(jìn)化程度，從而可以反映各自的進(jìn)化水平。核型為1 A的二倍體黑麥進(jìn)化程度較為原始，核型為2 A的六倍體小黑麥和八倍體小黑麥進(jìn)化程度相對(duì)較高。由表2可知，二倍體黑麥、六倍體小黑麥、八倍體小黑麥進(jìn)化指數(shù)分別為3、4、4，表明六倍體小黑麥和八倍體小黑麥進(jìn)化程度相同且高于二倍體黑麥的進(jìn)化水平。

3 討 論

本研究的2種小黑麥?zhǔn)怯伤谋扼w小麥(AABB,2 n=28)或普通小麥(AABBDD,2 n=42)和二倍體黑麥(RR,2 n=14)雜交培育獲得的雙二倍體，帶有親本A、B、(D)、R基因組。研究表明，小麥族B基因組中，1 B、6 B染色體帶有隨體[19]；二倍體黑麥1 R染色體帶有隨體[10]，但也有不同觀點(diǎn)，代明等[12]、Gill[20]的研究指出，有些黑麥染色體不帶有隨體，不同居群、生境、品種的黑麥染色體核型存在差別。小黑麥?zhǔn)侨斯ず铣傻淖魑?，含有親本2個(gè)不同物種的染色體，染色體遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，理論上六倍體小黑麥和八倍體小黑麥都應(yīng)該有6條染色體帶有隨體。然而，2種小黑麥根尖細(xì)胞觀察結(jié)果顯示，沒有帶6條隨體染色體的細(xì)胞出現(xiàn)。在部分六倍體小黑麥根尖細(xì)胞中，觀察到帶1條隨體染色體的情況，說明本試驗(yàn)所采用的六倍體小黑麥材料，至少應(yīng)該有2條染色體帶有隨體；在部分八倍體小黑麥根尖細(xì)胞中，觀察到帶有1條隨體、2條隨體、3條隨體染色體的情況，說明本實(shí)驗(yàn)所采用的八倍體小黑麥材料可能有4條或6條染色體帶有隨體。在武晶[13]的研究中，由四倍體硬粒小麥和二倍體黑麥培育的六倍體小黑麥Occurance 54-22核型公式為2 n=42=30 m(2 SAT)+2 M+8 sm+2 st(2 SAT)，含有普通小麥A、B基因組和黑麥R基因組，其中4條染色體帶有隨體，與理論上的6條帶隨體染色體數(shù)目不符。在本研究中，2種小黑麥材料體細(xì)胞中同樣未見與理論相符的帶隨體的染色體數(shù)目。

表1 麥類作物含R基因組3個(gè)物種染色體參數(shù)

種名染色體編號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度/%臂比類型二倍體黑麥(Secale cereal L.)18.75+8.17=16.921.07m29.03+6.46=15.491.40m39.89+5.51=15.401.79sm48.46+6.84=15.301.23m57.79+7.13=14.921.09m67.70+3.90=11.601.98sm*76.46+3.90=10.361.66m六倍體小黑麥(×Triticale hexaploide L.)13.13+2.89=6.021.08m23.27+2.43=5.701.35m33.55+2.01=5.561.77sm43.08+2.43=5.521.27m53.08+2.38=5.461.29m63.22+2.19=5.411.47m72.94+2.33=5.271.26m82.61+2.52=5.131.04m93.08+1.91=4.991.61m102.94+2.01=4.951.47m113.17+1.59=4.762.00sm122.33+2.33=4.661.00M132.85+1.77=4.621.61m142.85+1.77=4.621.61m152.99+1.49=4.482.00sm162.24+2.01=4.251.12m172.33+1.68=4.011.39m182.05+1.77=3.821.16m192.10+1.68=3.781.25m202.01+1.49=3.501.34m212.10+1.40=3.501.50m種名染色體編號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度/%臂比類型八倍體小黑麥(×Triticale octoploid L.)12.54+2.08=4.621.23m22.54+2.08=4.621.23m32.41+1.84=4.251.31m42.41+1.81=4.221.33m52.28+1.91=4.191.19m62.41+1.74=4.151.38m72.34+1.74=4.081.35m82.34+1.67=4.011.40m92.04+1.94=3.981.05m102.28+1.61=3.891.42m112.04+1.84=3.881.11m122.04+1.71=3.751.20m132.28+1.41=3.691.62m142.48+1.21=3.692.06sm151.84+1.84=3.681.00M161.98+1.67=3.651.18m171.94+1.67=3.611.16m181.84+1.54=3.381.20m191.87+1.44=3.311.30m201.91+1.41=3.321.36m211.74+1.41=3.151.24m221.81+1.27=3.081.42m231.41+1.41=2.821.00M241.81+1.00=2.811.80sm251.34+1.34=2.681.00M261.64+0.94=2.581.75sm271.47+1.00=2.471.47m281.41+1.04=2.451.35m

注：M、m、sm、*分別表示正中部著絲點(diǎn)染色體、中部著絲點(diǎn)染色體、近中部著絲點(diǎn)染色體、隨體，隨體長(zhǎng)度未計(jì)算在內(nèi)。

表2 麥類作物含R基因組3個(gè)物種染色體重要性狀及編碼

種名核型公式染色體長(zhǎng)度比平均臂比臂比大于1.7的比例不對(duì)稱系數(shù)/%進(jìn)化指數(shù)核型類型二倍體黑麥(Secale cereal L.)2n=2x=14=10m+4sm(2SAT)1.63(2*)1.46(0*)28.57(1*)58.08(0*)3*1A六倍體小黑麥(×Triticale hexaploide L.)2n=6x=42=2M+34m++6sm1.72(2*)1.41(0*)42.86(2*)57.91(0*)4*2A八倍體小黑麥(×Triticale octoploid L.)2n=8x=56=6M+44m+6sm1.89(2*)1.32(0*)42.86(2*)56.44(0*)4*2A

注：“*”為性狀狀態(tài)編碼數(shù)值。

目前，關(guān)于植物細(xì)胞隨體染色體的研究不夠深入，隨體的遺傳機(jī)制尚不明確。在禾本科植物中，普遍認(rèn)為水稻有2對(duì)帶隨體染色體，然而不同品種、不同生境的水稻有1對(duì)、2對(duì)、3對(duì)隨體染色體的報(bào)道[21,22]，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究成果對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行解釋，可能是因?yàn)槿旧w隨體伸長(zhǎng)或者隨體染色體的NOR活性不同引起的淡化導(dǎo)致的假象。另外，依據(jù)穆爾(莫慧英譯)提出的理論，也可能是因?yàn)楹巳屎喜⒒蛘哂H本中一個(gè)種的核仁中心對(duì)另一個(gè)種呈顯性導(dǎo)致隨體消失[23]。此外，Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)，二倍體小麥和黑麥在4 L上有相同的染色體重排斷點(diǎn)，5 L上的染色體重排斷點(diǎn)位置大體相近，表明小黑麥在進(jìn)化過程中極有可能在4 L5 L處發(fā)生相應(yīng)的異位，這些變化都可能引起同源共線性基因片段的變化或基因組的重排，從而發(fā)生染色體片段的倒位、重復(fù)、插入和缺失等現(xiàn)象，進(jìn)而影響染色體間的重組，最終導(dǎo)致麥類作物多倍性進(jìn)化歷程中核型的變化。

在本研究中，二倍體黑麥核型公式為2 n=2 x=14=10 m+4 sm(2 SAT)，核型類型為1 A，進(jìn)化指數(shù)為3；六倍體小黑麥核型公式為2 n=6 x=42=2 M+34 m+6 sm，核型類型為2 A，進(jìn)化指數(shù)為4；八倍體小黑麥核型公式為2 n=8 x=56=6 M+44 m+6 sm，核型類型為2 A，進(jìn)化指數(shù)為4，六倍體小黑麥和八倍體小黑麥核型進(jìn)化程度高于二倍體黑麥。由于小黑麥具有親本2個(gè)不同物種的全套基因，可以利用2個(gè)基因庫(kù)的基因來抵擋環(huán)境的變化，在進(jìn)化層面上，小黑麥應(yīng)該進(jìn)化程度更高，在農(nóng)藝生產(chǎn)中，小黑麥確實(shí)兼具黑麥和小麥的優(yōu)良性狀[25]，核型分析得出的結(jié)論也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。