崔樂(lè)樂(lè)， 劉佳月， 王照蘭, 呂汝婕,3， 杜建材

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/蒙古高原生態(tài)學(xué)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建草地生態(tài)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 呼和浩特 010021；3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)， 呼和浩特 010022)

有關(guān)干旱、半干旱地區(qū)植物種子萌發(fā)的研究在一年生植物上研究較多[1-2]，它們的萌發(fā)類型與多年生植物有很大的不同。由外因(物質(zhì)的或機(jī)械的)和內(nèi)因(形態(tài)學(xué)或生理學(xué))共同導(dǎo)致許多多年生植物種子的硬實(shí)[3]。而種皮不透水是多年生植物種共有的特性，例如豆科植物。豆科植物廣泛存在硬實(shí)現(xiàn)象[4-8]，可使種子在不同的時(shí)間相繼萌發(fā)，物種得以保存[9]。

硬實(shí)現(xiàn)象是植物在進(jìn)化過(guò)程中獲得的適應(yīng)不良環(huán)境的能力，可使種子在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)保持活力，尤其是在氣候多變的地區(qū)，能保證種子在最佳的環(huán)境條件下得以萌發(fā)[10]，對(duì)植物種質(zhì)資源的保存和傳播極為有利[11]。由于棲息地、種皮的滲透性、種子生理特性、生活史和對(duì)環(huán)境的反應(yīng)有所不同，占據(jù)相似生境條件的植物種往往表現(xiàn)出不同的硬實(shí)和萌發(fā)特性[12-13]。

在野生或自然條件下，環(huán)境的作用能改變植物硬實(shí)種子的種皮透性，使同一植物種的不同個(gè)體先后獲得發(fā)芽能力，其種子可在不同年份或同一年份的不同時(shí)間、當(dāng)水熱條件適宜時(shí)陸續(xù)出苗，保證了物種的延續(xù)[14]。但是，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，硬實(shí)嚴(yán)重影響田間出苗率[15]，導(dǎo)致出苗不整齊、發(fā)芽滯后等現(xiàn)象，難以進(jìn)行田間建植。因此，探索破除種子硬實(shí)的方法對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)是一種多年生豆科牧草，是重要的飼料作物。其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，分布范圍廣，草質(zhì)柔軟，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種全價(jià)飼料，其蛋白質(zhì)、能量、礦物質(zhì)及維生素的含量能夠滿足多種家畜生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)需要[16-17]。在我國(guó)，野生黃花苜蓿廣泛分布在東北、華北和西北，包括呼倫貝爾盟鄂溫克旗境內(nèi)，錫林郭勒盟錫林浩特周邊地區(qū)，赤峰克旗，新疆阿爾泰地區(qū)以及伊犁地區(qū)的新源縣、尼勒克縣、昭蘇縣、鞏留縣、察布查爾縣等干旱半干旱地區(qū)等。我國(guó)西藏地區(qū)也有黃花苜蓿的分布。其抗寒、抗旱性強(qiáng)，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中起著非常重要的作用。但是，黃花苜蓿和很多豆科植物一樣存在硬實(shí)率高的問(wèn)題，嚴(yán)重影響其推廣應(yīng)用。因此，破除黃花苜蓿硬實(shí)的研究具有重要意義。

采用多種方法系統(tǒng)研究打破黃花苜蓿種子硬實(shí)的報(bào)道較少。伊風(fēng)艷等[19]采用6種方法對(duì)野生黃花苜蓿種子硬實(shí)進(jìn)行了研究。本研究共采用13種方法對(duì)黃花苜蓿種子進(jìn)行處理，旨在篩選破除黃花苜蓿種子硬實(shí)最適宜的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)草原研究所培育的黃花苜蓿新品系種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)芽試驗(yàn)

將采用不同方法進(jìn)行硬實(shí)處理后的種子放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行室內(nèi)發(fā)芽，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子，以蒸餾水處理的種子作為對(duì)照，發(fā)芽溫度(22±2)℃，每天記錄種子的發(fā)芽數(shù)。根據(jù)國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程ISTA[20]，第10天統(tǒng)計(jì)正常幼苗數(shù)及硬實(shí)種子數(shù)，并計(jì)算發(fā)芽率、硬實(shí)率。

發(fā)芽率(%)=(正常幼苗數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

硬實(shí)率(%)=(未發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.2破除種子硬實(shí)處理

1) 低溫處理：分別將種子放進(jìn)4 ℃和-18 ℃冰箱內(nèi)處理7 d。

2) 液氮處理：用液氮處理種子3、10、15 min。

3) 熱水處理：分別用50、75、100 ℃ 熱水處理種子至水自然冷卻，將種子取出備用。

4) 高溫干燥處理：將種子放在30、50、70 ℃恒溫干燥箱中分別處理0.5、1、2、3 h。

5) 砂紙打磨處理：用80目的砂紙打磨種子直到種子表面失去光澤為止。

6) 激素(赤霉素，GA)處理：分別用200、400、600 mg·L-1的GA對(duì)種子進(jìn)行處理 6、24、36、48 h。

7) 鹽酸(HCl)處理：分別用10% HCl和濃HCl處理種子，在處理的10、20、30、40、60、80、120 min 取出備用。

8) 硫酸(H2SO4)處理：分別用10%、20%、40%、70%、98% 的H2SO4對(duì)種子進(jìn)行處理，每個(gè)濃度設(shè)置5、10、15、20、25、30、40、60 min等8個(gè)時(shí)間梯度。

9) NaOH處理：用10%、40% 的NaOH分別浸泡種子10、20、40、60、80、120 min。

10) KMnO4處理：用0.3%、0.9%的KMnO4溶液分別浸泡種子2、4 h。

11) KNO3處理：采用0.1%、0.2%、0.3%、0.5%共4個(gè)不同濃度的KNO3浸濕發(fā)芽床，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

12) NaCl處理：分別用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5% NaCl溶液浸濕發(fā)芽床，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

13) H2O2處理：采用30% H2O2對(duì)種子分別處理10、20、40、60、80、120 min。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件和SAS 9.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

本研究選用的黃花苜蓿種子自然發(fā)芽率只有29%，硬實(shí)率高達(dá)71%。低溫處理對(duì)黃花苜蓿的發(fā)芽率、硬實(shí)率均有影響(圖1)。4 ℃低溫處理能降低種子的硬實(shí)率，但差異未達(dá)到顯著水平。-18 ℃處理能使硬實(shí)率降低到52%，顯著低于對(duì)照(p<0.05)；發(fā)芽率提高到47%，顯著高于對(duì)照(p<0.05)。

圖1 低溫處理7 d破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.2 液氮處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

3 min、10 min、15 min不同時(shí)間梯度的液氮處理之間對(duì)破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果差異不顯著(p>0.05)，但三者均能顯著提高種子的發(fā)芽率(p<0.05)，最高可達(dá)64%，比對(duì)照增長(zhǎng)了35%，硬實(shí)率可降至33%(表1)。但發(fā)芽后的幼苗，在生長(zhǎng)過(guò)程中的死亡率增加。結(jié)果表明，液氮在提高種子發(fā)芽率的同時(shí)也對(duì)種子造成了很大的傷害。

表1 液氮處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

處理時(shí)間/min發(fā)芽率/%死苗率/%死種率/%硬實(shí)率/%液氮364a22333b1062a24335b1564a26036bck29b0071a

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)顯著水平(p<0.05)。下同。

2.3 熱水處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

黃花苜蓿的發(fā)芽率隨著浸種熱水的溫度升高而升高(圖2)。50 ℃熱水處理種子的發(fā)芽率、硬實(shí)率與對(duì)照差異不顯著(p>0.05)。75 ℃熱水浸種可顯著提高其種子發(fā)芽率，達(dá)47%，但硬實(shí)率下降不顯著。100 ℃熱水處理發(fā)芽率升高到62%，硬實(shí)率下降至38%，比對(duì)照降低了33%，二者差異顯著(p<0.05)。

注：不同小寫(xiě)字母代表不同溫度之間差異顯著(p<0.05)。

2.4 高溫干燥處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

高溫干燥處理對(duì)種子發(fā)芽率和硬實(shí)率的影響如圖3所示。其中，30 ℃和50 ℃的各個(gè)時(shí)間梯度處理與對(duì)照相比硬實(shí)率破除效果均不顯著(p>0.05)。70 ℃高溫干燥在各個(gè)時(shí)間梯度處理下硬實(shí)率均顯著降低，其中，以1 h處理下降幅度最大，降至45.1%，與未處理的對(duì)照相比(71%)，降低了25.9%。

注：不同小寫(xiě)字母代表同一溫度不同處理時(shí)間之間差異顯著(p<0.05)。下同。

圖6 H2SO4處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.5 砂紙打磨處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

如表2所示，適度的砂紙打磨處理能完全破除供試黃花苜蓿品系的種子硬實(shí)，硬實(shí)率降為0，發(fā)芽率升高到98%，與對(duì)照相比提高了69%。只有2%的種子發(fā)生死種現(xiàn)象。

表2 砂紙打磨處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

處理發(fā)芽率/%死種率/%硬實(shí)率/%ck29b071a砂磨98a20b

2.6 GA處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

GA處理對(duì)黃花苜蓿種子發(fā)芽率的影響如圖4所示。200 mg·L-1GA處理6 h，發(fā)芽率達(dá)41%，提高了12%；硬實(shí)率降低至59%，降低了12%；24、36、48 h的處理，效果不顯著。

400 mg·L-1GA處理24 h，發(fā)芽率達(dá)41%，提高了12%；硬實(shí)率降低至56.7%，降低了14.3%；其它時(shí)間的處理，效果均不佳。

600 mg·L-1GA處理6 h能使發(fā)芽率提高到46%，比對(duì)照提高了17%；硬實(shí)率降低至54%，降低了17%；其它時(shí)間的處理，效果均不顯著。

圖4 GA處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.7 HCl處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2個(gè)濃度的HCl處理不同時(shí)間，對(duì)供試黃花苜蓿種子破除硬實(shí)率的效果均不理想。多數(shù)處理沒(méi)有顯著影響(圖5)；10% HCl 處理40 min、60 min和80 min，發(fā)芽率提升雖然均達(dá)到顯著水平(p<0.05)，但其處理后的種子硬實(shí)率依然較高，分別為66%、65%、65%。

圖5 HCl處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.8 H2SO4處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

不同濃度梯度和時(shí)間梯度的H2SO4浸種對(duì)黃花苜蓿的發(fā)芽率和硬實(shí)率有不同的影響(圖6)。10%、20%、40%、70% H2SO4在各個(gè)時(shí)間梯度處理下，破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果均不理想。98% H2SO4浸種，在各個(gè)時(shí)間處理梯度上對(duì)破除黃花苜蓿種子硬實(shí)均有顯著效果(p<0.05)。其中，處理5 min時(shí)，發(fā)芽率可從29%提高至48.66%；處理10 min、15 min和20 min 時(shí)，發(fā)芽率分別為75%、70%和73%，三者之間差異不顯著；處理25 min時(shí)，發(fā)芽率可達(dá)84%，處理40 min時(shí)，發(fā)芽率達(dá)88%，處理60 min時(shí)，發(fā)芽率達(dá)到91%，硬實(shí)率分別下降到16%、10%和8%，但三者之間差異不顯著。

2.9 NaOH處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

10% NaOH處理20 min 能使黃花苜蓿種子硬實(shí)率從71%降低至58%，二者差異顯著(p<0.05)。該濃度下的其它時(shí)間處理效果與對(duì)照相比均不顯著(圖7)。

40% NaOH處理10 min，能使供試黃花苜蓿種子發(fā)芽率從29%提高到42%，硬實(shí)率降低至58%，和10% NaOH處理20 min效果相同。該濃度下的其它時(shí)間處理效果均不明顯(圖7)。

圖7 NaOH處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.10 KMnO4處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

0.3%和0.9%的KMnO4處理2 h對(duì)破除黃花苜蓿種子硬實(shí)均無(wú)顯著效果；處理4 h的硬實(shí)率分別為62%和60%，硬實(shí)率下降幅度均達(dá)到顯著水平(p<0.05)(圖8)。

圖8 KMnO4處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.11 KNO3處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

不同濃度的KNO3處理對(duì)破除黃花苜蓿種子硬實(shí)均無(wú)顯著效果(p>0.05)(圖9)。

圖9 KNO3處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.12 NaCl處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

隨著NaCl濃度的升高發(fā)芽率呈先增加后減少的趨勢(shì)(圖10)。0.2%的NaCl處理能顯著提高供試黃花苜蓿種子的發(fā)芽率(40.7%)，降低硬實(shí)率(59.3%)(p<0.05)；0.4%、0.6% NaCl處理下的發(fā)芽率與對(duì)照相比均無(wú)顯著差別(p>0.05)；當(dāng)NaCl處理濃度升高至0.8% 以上時(shí)，不僅不能破除硬實(shí)，反而抑制種子萌發(fā)。

圖10 NaCl處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

2.13 H2O2處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

30% H2O2處理20 min能顯著降低硬實(shí)率、提高發(fā)芽率(圖11)。當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至40 min時(shí)，硬實(shí)率反而升高至79%，發(fā)芽率降低到21%。60 min、80 min、120 min處理之間，發(fā)芽率和硬實(shí)率與對(duì)照相比，均無(wú)顯著差異(p>0.05)。

圖11 30% H2O2處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果

3 討 論

Acharya 等認(rèn)為，機(jī)械處理能提高種子的發(fā)芽率，是商業(yè)用途的首選[21]。Carleton 等研究表明，劃破鷹嘴豆種皮可以使其發(fā)芽率從20%提高到86%，并且處理后的種子發(fā)芽更快，田間出苗均勻一致[22]。Uzun 等認(rèn)為，砂紙打磨能提高苜蓿和三葉草的發(fā)芽率[23]。杜建材等研究表明，砂紙打磨能完全破除扁蓄豆品系90-36種子的硬實(shí)率[24]。本研究采用多次打磨破除種子硬實(shí)，最終能使種子發(fā)芽率提高至98%。砂紙打磨簡(jiǎn)單、安全，而且對(duì)批量種子破除硬實(shí)時(shí)操作方便，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值較大。

Carleton 等[22]以及Tomer 等[25]認(rèn)為，濃H2SO4處理能破除豆科牧草的硬實(shí)；羅廣軍等研究表明，98% H2SO4浸種60 min能有效的破除甘草種子的硬實(shí)[26]；Long 等對(duì)黃芪進(jìn)行不同時(shí)間梯度的濃H2SO4處理，結(jié)果表明，濃H2SO4處理30 min和處理40 min時(shí)能顯著提高發(fā)芽率到94%～96%[27]。王玉珍等[28]用10%的H2SO4處理黃花苜蓿種子24 h，播種當(dāng)年田間出苗率更均勻，幼苗數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照。該項(xiàng)研究的主要問(wèn)題是用10%的H2SO4處理種子24 h，在實(shí)際應(yīng)用中耗時(shí)長(zhǎng)、不利于安全和操作。本研究采用98% H2SO4處理黃花苜蓿種子25 min、40 min、和60 min，均獲得了較好的硬實(shí)破除效果，發(fā)芽率分別達(dá)到84%、88%和91%，三者之間差異不顯著，為了安全操作(處理不超時(shí)、不損傷種子)和節(jié)省時(shí)間，在實(shí)際生產(chǎn)中，建議采用98% H2SO4處理種子25 min即可。

研究表明，H2O2能在一定程度上破除沙冬青種子的硬實(shí)[4]。本研究用30% H2O2處理20 min，可使黃花苜蓿種子硬實(shí)率有所下降(65%)，但下降幅度較小，H2O2的整體處理效果并不理想。Uzun 等[23]用25 mg·L-1赤霉素浸種處理，未能顯著提高波斯三葉草(T.resupinatum)種子發(fā)芽率，卻提高了另外2種三葉草(T.meneghinianum和T.striatum)的發(fā)芽率。本研究200 mg·L-1GA浸種6 h、400 mg·L-1GA浸種24 h和600 mg·L-1GA浸種6 h，對(duì)破除黃花苜蓿種子的硬實(shí)率均有一定的積極作用，但處理后的種子硬實(shí)率仍然較高，在59%～54%之間。

溫度也是影響種子萌發(fā)的一個(gè)主要因素[29]。Imrie對(duì)綠豆進(jìn)行高溫干燥處理表明，125 ℃、150 ℃處理60 s和175 ℃、200 ℃處理30 s使發(fā)芽率提高到94%以上，硬實(shí)率下降到5%以下，175 ℃、200 ℃處理60 s能使硬實(shí)率下降到1%以下，但是種子受到傷害[30]。Uzun 等研究表明，3 ℃預(yù)冷7 d沒(méi)有顯著提高苜蓿的發(fā)芽率，浸入75 ℃水中處理5 min能使三葉草的發(fā)芽率由11%提高到82.8%[23]。Brant 等研究表明，高溫干燥處理能降低種子的硬實(shí)率[31]。Long 等將黃芪種子放入網(wǎng)袋浸入沸水中10 min，有效破除了黃芪種子的硬實(shí)性[27]。本研究100 ℃熱水處理、-18 ℃低溫處理7 d、70 ℃高溫處理0.5～3 h，均能部分打破黃花苜蓿種子硬實(shí)。液氮處理3、10、15 min也能顯著降低黃花苜蓿種子硬實(shí)率，但是液氮處理對(duì)種子傷害較大，種子萌發(fā)后的死苗現(xiàn)象嚴(yán)重。

在其它化學(xué)處理中，0.3%和0.9% KMnO4處理4 h、10%的HCl處理40～80 min、10% NaOH處理20 min、40% NaOH處理10 min、以及0.2% NaCl浸種處理對(duì)打破黃花苜蓿種子硬實(shí)也有一定的積極效果，但處理后的硬實(shí)率還在60%左右。KNO3的所有處理對(duì)破除參試黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果均不顯著。

破除種子的硬實(shí)性，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中保證高效栽培的重要措施之一。但對(duì)植物來(lái)說(shuō)，種皮暫時(shí)不受水和氣體的影響，即使它們處于理想的發(fā)芽條件下也不會(huì)發(fā)芽，便產(chǎn)生硬實(shí)種子。硬實(shí)種子較耐老化，比軟種子具有更好的耐貯藏性。硬實(shí)種子需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理才能在發(fā)芽前解除種皮的約束，是保證種子萌發(fā)在最有利環(huán)境下發(fā)生的生存策略，它能提高種子壽命和種群持久性。種子的高硬實(shí)性，通過(guò)防止季節(jié)降雨的萌發(fā)，有助于維持土壤種子庫(kù)，它也是一種重要的環(huán)境適應(yīng)和生存策略。同時(shí)，高硬實(shí)性也會(huì)導(dǎo)致植物種發(fā)芽期的延長(zhǎng)，可以增加獲得良好立地的機(jī)會(huì)。

4 結(jié) 論

13種方法破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果不同。適度砂紙打磨處理破除黃花苜蓿種子硬實(shí)的效果最好，能使發(fā)芽率達(dá)到98%，硬實(shí)率降低至零。另外，98%的濃硫酸處理黃花苜蓿種子25～60 min，硬實(shí)率可下降到16%以下，即發(fā)芽率可達(dá)84%以上。其它處理的效果均不理想。