陳朝琴，薛治乾，李文霞

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，影響著全球4億多人的健康[1]。隨著發(fā)病率的逐年攀升，糖尿病被視為繼腫瘤、心血管疾病之后的位于第三位威脅人類健康的慢性疾病[2]，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。目前，糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，胰島β細(xì)胞功能受損與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。淫羊藿是小檗科植物淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥地上部分[5]，具益精氣、補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功，用于腎陽(yáng)虛衰、陽(yáng)痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣[6]。資料顯示，以EH、人參、黃精等多種藥物配制而成的津力達(dá)顆粒對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用[7]，黔產(chǎn)粗毛EH、黔嶺EH可以改善四氧嘧啶誘發(fā)的2型糖尿病模型小鼠胰腺組織損傷[8]，但EH對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞影響方面的研究尚不多見(jiàn)。本研究擬從細(xì)胞學(xué)水平探索EH對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞RINm5F損傷的作用及其可能的分子機(jī)制，為EH在糖尿病的臨床治療提供新思路，同時(shí)也為糖尿病的診治提供潛在的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器 胰島細(xì)胞系RINm5F購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，EH購(gòu)自上海源葉生物公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，棕櫚樹(shù)酸(PA)、葡萄糖、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RIPA裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，miRNA提取試劑盒購(gòu)自上海Qiagen公司，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(TBST)購(gòu)自上海生工生物工程公司，胰酶、凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR(aPCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司。臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RINm5F細(xì)胞復(fù)蘇后，置含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每24 h更換培養(yǎng)液一次，使用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞同步化后隨機(jī)分為對(duì)照組(Con組，5 mmol/L葡萄糖)、高糖高脂組(HGL組，25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA)、低劑量EH組(低劑量EH組，25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+10 μmol/L EH)和高劑量EH組(高劑量EH組，25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+100 μmol/L EH)。EH干預(yù)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-19a-3p表達(dá) 按照miRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的指示，提取RINm5F細(xì)胞中總miRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以制成的cDNA為模板，U6為參照，采用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min，循環(huán)40次，收集Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-19a-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集HGL組和不同劑量EH組RINm5F細(xì)胞，以1×105個(gè)/毫升的密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，利用Lipofectamine 2000型試劑將miR-19a-3p和anti-miR-19a-3p質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入RINm5F細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 蛋白印跡法(Western blotting) 采用Western blotting分析各種蛋白的表達(dá)情況。收集Con組、HGL組和不同濃度EH組(10、100 μmol/L)RINm5F細(xì)胞，加入RIPA裂解液獲得總蛋白，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(DS-PAGE)分離蛋白，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并于5%脫脂奶粉封閉1 h。將膜與相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入TBST充分洗滌，與辣根過(guò)氧化物標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，加入TBST充分洗滌。利用化學(xué)發(fā)光液中顯色、顯影，以GAPDH為對(duì)照，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組RINm5F細(xì)胞，使用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，接種于96孔細(xì)胞板，每組處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入100 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃搖床振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞吸光值(OD490nm值)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，各組細(xì)胞OD490nm值為縱坐標(biāo)，繪制生存曲線。其中，OD490nm值越高，細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 各處理RINm5F細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，使用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升，加入500 μL Annexin V緩沖液重懸細(xì)胞，隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管，在室溫黑暗條件下用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EH對(duì)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞增殖的影響 MTT對(duì)HGL刺激的RINm5F細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HGL組細(xì)胞增殖活性有所下降，24 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，48 h和72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HGL組相比，不同濃度EH處理后，RINm5F細(xì)胞增殖活性逐漸上升，24 h時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，48 h和72 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

Western blotting檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HGL組細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)量驟減(P<0.05)，P21表達(dá)量增加顯著(P<0.05)；與HGL組相比，不同劑量的EH組干預(yù)后，細(xì)胞CyclinD1水平明顯提高(P<0.05)，P21水平明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表1)。

2.2 EH對(duì)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)HGL誘導(dǎo)RINm5F細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組比較，HGL作用于RINm5F細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率大幅增加(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表2)，Bax表達(dá)量明顯提高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)量明顯減少(P<0.05)(見(jiàn)圖3和表2)。與HGL組比較，不同劑量的EH處理RINm5F細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.05)(見(jiàn)圖2和表2)，Bax水平有所降低(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)量增加(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表2)。

表1 EH對(duì)HGL刺激的RINm5F細(xì)胞活性及CyclinD1、P21蛋白表達(dá)的影響

與Con組比較*P<0.05；與HGL組比較△P<0.05

2.3 EH對(duì)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞miR-19a-3p表達(dá)的影響 HGL誘導(dǎo)RINm5F細(xì)胞損傷后，細(xì)胞中miR-19a-3p表達(dá)量明顯高于Con組(P<0.05)；加入不同劑量的EH，miR-19a-3p表達(dá)水平低于HGL組(P<0.05)，高劑量EH組miR-19a-3p表達(dá)量差異最顯著(見(jiàn)表3)，故選擇高劑量EH組進(jìn)行后續(xù)研究。

分組凋亡率/%BaxBcl-2Con組4.32±0.370.14±0.010.89±0.01HGL組17.25±1.01?0.76±0.02?0.29±0.01?低劑量EH組14.31±1.00△0.62±0.01△0.43±0.01△高劑量EH組10.03±0.58△0.45±0.01△0.57±0.01△F151.8731 222.1431 979.000P<0.010.010.01MS組內(nèi)0.6230.0000.000

與Con組比較*P<0.05；與HGL組比較△P<0.05

分組miR-19a-3pCon組0.18±0.01HGL組0.75±0.05?低劑量EH組0.60±0.04△高劑量EH組0.43±0.03△F140.706P<0.01MS組內(nèi)0.001

與Con組比較*P<0.05；與HGL組比較△P<0.05

2.4 抑制miR-19a-3p表達(dá)對(duì)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞增殖的影響 在HGL損傷的RINm5F細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-19a-3p，miR-19a-3p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，說(shuō)明anti-miR-19a-3p載體成功轉(zhuǎn)染入RINm5F細(xì)胞。觀察抑制miR-19a-3p表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響顯示，抑制miR-19a-3p表達(dá)組24 h時(shí)的細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，48 h和72 h時(shí)，細(xì)胞增殖活性顯著高于HGL+anti-miR-NC組(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平明顯高于HGL+anti-miR-NC組(P<0.01)，P21蛋白表達(dá)量則顯著減少(P<0.01)(見(jiàn)表4、圖4)。

2.5 抑制miR-19a-3p表達(dá)對(duì)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞凋亡的影響 抑制miR-19a-3p表達(dá)較HGL+anti-miR-NC組降低HGL所致的RINm5F細(xì)胞凋亡率(P<0.01)和Bax蛋白水平(P<0.01),提升Bcl-2蛋白水平(P<0.01)(見(jiàn)表5、圖5)。

2.6 過(guò)表達(dá)miR-19a-3p能逆轉(zhuǎn)EH對(duì)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞增殖、凋亡的作用 在高劑量EH組RINm5F細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-19a-3p，發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p表達(dá)量高于對(duì)照HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC組(P<0.01)。與HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC組相比，過(guò)表達(dá)miR-19a-3p組48 h和72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)，同時(shí)，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)量減少(P<0.01)，P21和Bax蛋白水平提高(P<0.01)(見(jiàn)表6～7、圖6)。

表4 抑制miR-19a-3p表達(dá)對(duì)HGL刺激的RINm5F細(xì)胞增殖的影響

分組凋亡率/%BaxBcl-2HGL+anti-miR-NC17.28±1.320.75±0.020.27±0.01HGL+anti-miR-19a-3p12.92±0.920.54±0.020.47±0.02t4.6912.8615.49P<0.01<0.01<0.01

與HGL+anti-miR-NC組比較※P<0.05

3 討論

EH始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為補(bǔ)益藥，距今已有2 000多年的藥用歷史[9]。EH是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，主要活性成分包括EH苷、EH次苷、EH總黃酮、EH多糖以及一些微量元素等[10]，在心血管、生殖、免疫、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病的治療中擁有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[11]。此外，EH還可降血糖，用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療[12-14]。糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素綜合作用所致，血糖、血脂異常升高是糖尿病重要的臨床特征[15]。胰島的β細(xì)胞分泌胰島素，在整個(gè)代謝中發(fā)揮著核心作用，而胰島素是人體唯一能降低血糖的激素，當(dāng)β細(xì)胞分泌胰島素的能力與機(jī)體對(duì)胰島素的需求不匹配，會(huì)引發(fā)糖尿病，最初，面對(duì)胰島素的抵抗，β細(xì)胞會(huì)增加胰島素?cái)?shù)量，但隨著β細(xì)胞功能的下降，最終導(dǎo)致高血糖[16]。β細(xì)胞異質(zhì)性已成為胰島功能的重要貢獻(xiàn)者，對(duì)糖尿病產(chǎn)生潛在影響[17]。近年來(lái)，有學(xué)者[18]利用高糖高脂誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷模型，研究糖尿病的相關(guān)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，利用胰島β細(xì)胞RINm5F進(jìn)行研究，以葡萄糖和棕櫚樹(shù)酸構(gòu)建高糖高脂損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖高脂刺激的RINm5F細(xì)胞增殖活性和Bcl-2表達(dá)水平顯著低于對(duì)照，而細(xì)胞凋亡率和Bax表達(dá)高于對(duì)照，這與張萌等[19]的研究結(jié)果一致。另外，高糖高脂增加了細(xì)胞中P21表達(dá)而降低CyclinD1表達(dá)量。不同劑量的EH處理后，細(xì)胞增殖能力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于模型組，細(xì)胞凋亡率、P21和Bax蛋白水平則顯著低于模型組，說(shuō)明EH可以減輕高糖高脂對(duì)RINm5F細(xì)胞的損傷，抑制細(xì)胞凋亡。

微小RNAs(MicroRNAs,miRNAs/miR)是一種內(nèi)源性短鏈(長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸)非編碼RNA，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過(guò)程，影響許多疾病的發(fā)生發(fā)展，包括糖尿病及其并發(fā)癥[20-22]。研究[23]表明，miRNA-19a在胰腺癌合并糖尿病病人中表達(dá)上調(diào)，可作為有效的血清標(biāo)志物[23]，miR-19a在冠心病合并糖尿病病人循環(huán)血中明顯高于健康人員[24]，利拉魯肽對(duì)新診斷2型糖尿病胰島β細(xì)胞功能的改善作用可能與血清中miR-19a表達(dá)下調(diào)有關(guān)[25]。本研究中，miR-19a-3p在高糖高脂損傷和不同劑量EH干預(yù)的細(xì)胞中表達(dá)量異常。在HGL損傷的RINm5F細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-19a-3p，發(fā)現(xiàn)抑制miR-19a-3p表達(dá)較相應(yīng)對(duì)照顯著提高HGL誘導(dǎo)的RINm5F細(xì)胞增殖活性、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡、P21和Bax蛋白水平，與EH對(duì)高糖高脂環(huán)境中RINm5F細(xì)胞的作用結(jié)果相似。

表6 過(guò)表達(dá)miR-19a-3p能逆轉(zhuǎn)EH對(duì)HGL刺激的RINm5F細(xì)胞增殖、凋亡的作用

表7 相關(guān)蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步觀察EH是否通過(guò)miR-19a-3p來(lái)影響高糖高脂損傷的RINm5F細(xì)胞，將miR-19a-3p轉(zhuǎn)染至高劑量EH組RINm5F細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-19a-3p可以逆轉(zhuǎn)EH對(duì)高糖高脂刺激下RINm5F細(xì)胞增殖、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，以及逆轉(zhuǎn)EH對(duì)高糖高脂刺激下RINm5F細(xì)胞凋亡、P21和Bax蛋白表達(dá)的抑制作用。由此可見(jiàn)，EH保護(hù)高糖高脂刺激的胰島β細(xì)胞損傷與miR-19a-3p表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，高糖高脂會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷，影響細(xì)胞增殖和凋亡，而EH能夠減輕高糖高脂刺激的胰島β細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)miR-19a-3p表達(dá)有關(guān)。這將為EH和miR-19a-3p在糖尿病中的運(yùn)用提供理論參考。