段鋼 陳宏亮 郭開今 陳向陽

骨缺損是骨科常見的病理現(xiàn)象，多出現(xiàn)于腫瘤切除、運動損傷和感染等疾病患者，可能對人體正常肌肉骨骼系統(tǒng)和心理造成嚴重損害，通常需要通過手術(shù)植骨對病灶進行修復[1-2]。近年來骨修復相關(guān)研究取得了很大進展，但由于骨修復是一個復雜的過程，骨缺損真實形態(tài)和功能的重建仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。較大體積骨缺損的修復是臨床治療的難點，也是目前骨組織工程研究的熱點。自體骨被認為是替代骨的最佳材料，但是供骨來源有限，同時自體骨移植手術(shù)存在擴大創(chuàng)傷、增加感染的風險；同種異體骨需要經(jīng)過滅菌和滅活后應(yīng)用，雖然存在骨支架的解剖結(jié)構(gòu)，但是失去了成骨誘導和骨生成作用，且存在免疫排斥和傳播疾病的可能，同時受到其他經(jīng)濟和倫理方面等因素的影響，其應(yīng)用也受到了一定限制[1]。因此，研發(fā)一種結(jié)構(gòu)和性能穩(wěn)定、具有骨傳導和骨誘導生成作用的骨修復材料對于臨床骨缺損的修復有重要意義[3-5]。β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)是一種新型骨填充材料，具有易于塑形、可誘導成骨、在體內(nèi)降解、生物相容性好等優(yōu)點，目前在臨床骨修復治療中已經(jīng)得到應(yīng)用，是一種較理想的骨修復替代材料[6-8]。3D打印技術(shù)可以精準快速打印出所設(shè)計的具有復雜形態(tài)的個性化人工骨支架，其低溫打印技術(shù)可以使用多種組織工程材料。通過3D打印技術(shù)以β-TCP為材料制備的仿生骨支架既具備必需的支撐強度，同時后期又不會妨礙新生組織的生長，使骨傳導及時獲得有效的血液供應(yīng)。β-TCP是3D打印人工骨支架的理想材料[9-10]。本研究以β-TCP為材料，采用3D打印技術(shù)制備仿生骨支架，觀測其結(jié)構(gòu)形態(tài)、孔隙率和力學強度，同時以動物實驗檢測其部分相關(guān)生物性能，為3D打印β-TCP仿生骨支架的臨床用應(yīng)提供理論支持。

資料與方法

一、主要材料、設(shè)備和實驗動物

β-TCP粉末(英國百賽公司，英國)、稀檸檬酸、磷酸氫二鉀、氧化鋅、二氧化硅(自備)；JSM-5600LV掃描電鏡(日本電子株式會社，日本)；3D-BIOPLOTTER?三維生物打印系統(tǒng)(EnvisionTEC 公司，德國)；新西蘭大白兔(徐州醫(yī)科大學動物中心，中國)。

二、β-TCP仿生骨支架的設(shè)計和制備

1. 3D打印墨水的制備：在β-TCP粉末中加入20 wt%檸檬酸以固液比1∶0.35混合，調(diào)和至稀糊狀，加入定量磷酸二氫鉀、氧化鋅、二氧化硅，攪拌均勻后，在37℃、100%濕度環(huán)境中固化72 h備用。

2. β-TCP 仿生骨支架的制備：將通過顯微CT掃描獲得的新西蘭大白兔股骨髁解剖結(jié)構(gòu)影像參數(shù)導入計算機Mimics 15.01軟件，應(yīng)用Geomagic Studio 2013軟件分割出股骨髁內(nèi)部骨小梁的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，最后采用系統(tǒng)默認的最優(yōu)三維重建方式進行實驗部骨骼內(nèi)骨小梁仿真結(jié)構(gòu)的三維重建。以系統(tǒng)控制軟件設(shè)計大體形態(tài)為直徑8 mm、長10 mm圓柱體，內(nèi)部為仿生骨小梁和孔隙構(gòu)成，孔隙率(內(nèi)部孔隙體積占總體積的百分比)為65%的支架構(gòu)型，以STL格式輸入3D打印機，調(diào)用200 μm噴頭，行走速度為100 mm/min，制備β-TCP仿生骨支架成品25枚，均采用γ射線消毒處理。以隨機數(shù)字表法對其中10枚β-TCP仿生骨支架的大體形態(tài)、內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)以及力學性能進行檢測；另外15枚β-TCP仿生骨支架備用于動物模型實驗。

3. β-TCP 仿生骨支架大體型態(tài)的測量：使用游標卡尺測量實驗制作的β-TCP仿生骨支架成品大體形態(tài)。分別對每個支架的高度和直徑進行測量，同一層面測量3次，通過獲取每個支架指標平均值計算支架大體型態(tài)的相應(yīng)平均值。

4. β-TCP 仿生骨支架內(nèi)部孔徑形態(tài)及孔隙率的測定：通過數(shù)碼相機和JSM-5600LV掃描電子顯微鏡對固化后的β-TCP仿生骨支架的孔道結(jié)構(gòu)進行觀察。根據(jù)Geomagic Studio 2013軟件設(shè)計的仿生骨支架的三維形態(tài)，可以直接使用計算機測算支架結(jié)構(gòu)仿生骨小梁直徑，以及連通孔道的內(nèi)徑和孔隙率，每個測量層面隨機選取3個大孔和3個微孔進行測量，通過獲取每個支架的對應(yīng)平均值計算支架整體內(nèi)部孔徑形態(tài)及孔隙率的平均值。

5. β-TCP 仿生骨支架力學性能的檢測：使用萬能力學試驗機(AG-2000A，島津公司，日本)以載荷速度0.5 mm/min、最大壓力2 000 N對β-TCP 仿生骨支架的壓縮強度進行測量。對10個平行樣本進行靜態(tài)壓縮力學性能(壓縮力學強度)測定，樣品在37℃磷酸鹽緩沖液中浸泡36 h，壓縮加載速度為0.1 mm/min，溫度為25℃。β-TCP生物陶瓷是脆性材料，斷裂即失效[11]，因此以最大拉應(yīng)力理論作為其斷裂準則。采用ANSYS 14.0有限元分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，最大拉應(yīng)力對應(yīng)于第一主應(yīng)力，將β-TCP仿生骨支架的極限拉應(yīng)力作為臨界第一主應(yīng)力進行有限元分析，根據(jù)壓力-應(yīng)力曲線獲得數(shù)據(jù)，查文獻獲得泊松比為0.28[12]。

三、動物實驗

本實驗研究獲徐州醫(yī)科大學倫理委員會審批。實驗在徐州醫(yī)科大學動物實驗中心完成。隨機選取新西蘭大白兔30只，性別不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，飼養(yǎng)1周后，以抽簽法將動物隨機分配為實驗組和對照組，每組15只。使用3%水合氯醛以3 ml/kg劑量對實驗兔進行腹腔注射麻醉，起效后常規(guī)備皮、消毒鋪單。取兔左膝關(guān)節(jié)外側(cè)長2 cm切口，顯露股骨遠端，于側(cè)副韌帶與腓側(cè)韌帶之間中點處，平行膝關(guān)節(jié)橫軸鉆直徑約8 mm、長約10 mm圓柱形骨缺損，以生理鹽水沖洗創(chuàng)面，清除骨屑和凝血塊，以干紗布填塞，使骨面保持干燥。實驗組植入預(yù)先制備的個性化β-TCP仿生骨支架，對照組不植入任何材料，之后逐層縫合深筋膜、淺筋膜和皮膚。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每天肌肉注射青霉素10×104 U/kg，連續(xù)3 d。觀察術(shù)后實驗動物的飲食、活動及傷口情況。在術(shù)后第4、8、12周對兩組各5只兔行麻醉下手術(shù)，分別對實驗組兔植骨部位和對照組兔骨缺損部位進行取材，以10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫鈣、脫水、石蠟包埋、沿垂直方向切片和HE染色，使用光學顯微鏡觀察有無炎性反應(yīng)、骨組織長入以及材料降解情況。

四、標本組織學評價

依據(jù)光學顯微鏡下所見，采用Lane-Sandhu組織學評分方法(表1)對實驗組兔術(shù)后植入β-TCP仿生骨支架部位和對照組兔術(shù)后骨缺損部位的骨愈合情況進行評價。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、β-TCP仿生骨支架的形貌和結(jié)構(gòu)特征

β-TCP仿生骨支架的大體外觀結(jié)構(gòu)均與設(shè)計形態(tài)接近，直徑為(7.89±0.07)mm，高度為(9.97±0.08)mm(圖1)；表面及內(nèi)部可見類似于骨組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)，小梁交錯連接，中間孔隙相互連通，大孔的周圍布滿更小的微孔，小梁直徑5～50 μm，其間較大孔道內(nèi)徑為(223.02±18.20)(200～300)μm，微孔內(nèi)徑為(15.06±0.09)μm，孔隙率為(65.10±1.38)%，與設(shè)計參數(shù)接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。β-TCP仿生骨支架具有較好的貫通結(jié)構(gòu)，與骨骼結(jié)構(gòu)形態(tài)有極佳的相似性，且無明顯收縮形變，各項大體形態(tài)參數(shù)值見表2。

二、β-TCP仿生骨支架的生物力學強度

β-TCP仿生骨支架平均最大壓縮強度為(3.83±0.65)MPa(表2)。β-TCP仿生骨支架壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線的第1個峰為支架的抗壓強度。由第一主應(yīng)力分布云圖可見，當?shù)谝恢鲬?yīng)力作用時受力最大的部位是材料中部(圖3)。

三、動物實驗結(jié)果

實驗兔術(shù)后第2天即正常飲食；術(shù)口無紅腫等炎癥跡象，一期甲級愈合；手術(shù)側(cè)肢體跛行，平均1周后可正常行走，觀察期間行動自如；1只兔死亡，二次手術(shù)補齊。組織學觀察結(jié)果：術(shù)后4周，實驗組

表1 Lane-Sandhu組織學評分方法

圖1 對β-TCP仿生骨支架成品進行大體形態(tài)測量 A 支架正面(側(cè)面)觀 B 支架上面(橫截面)觀 C 多枚支架 D 使用游標卡尺測量支架橫截面直徑

圖2 實驗兔股骨髁骨微觀結(jié)構(gòu)的Micro-CT三維重建像與掃描電子顯微鏡下β-TCP仿生骨支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài) A,B 根據(jù)Micro-CT掃描松質(zhì)骨標本內(nèi)部結(jié)構(gòu)所得數(shù)據(jù)進行三維重建像的側(cè)面觀與橫截面觀，可見骨小梁呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑相互連通，大小不均 C,D 掃描電子顯微鏡下β-TCP仿生骨支架的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)，仿生骨小梁連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，中間形成較大的孔徑相通，仿生骨小梁上分布微孔，與大孔徑相連，圖像顯示標尺分別為200 μm和50 μm兔植骨處可見較成熟的骨組織，骨小梁和骨髓組織增多，新生骨正在逐漸取代植入材料，對照組兔骨缺損處周圍可見少量成骨細胞；術(shù)后8周，實驗組兔植骨處可見植入材料周圍出現(xiàn)骨小粱、成骨細胞和破骨細胞，同時出現(xiàn)少量新生骨并向植入材料內(nèi)長入，對照組兔骨缺損處周圍有少量類骨組織形成，大量成纖維細胞和脂肪組織長入；術(shù)后12周，實驗組兔植骨處出現(xiàn)成熟的骨小梁和骨髓組織，有編織骨形成，新生骨量較多，植入材料存留較少，表示已轉(zhuǎn)化為成熟骨組織，對照組兔骨缺損處見少量骨組織從缺損邊緣向內(nèi)長入，大部分被成纖維細胞和脂肪組織填充(圖4，5)。兩組Lane-Sandhu組織學評分差異有統(tǒng)計學意義(表4)。

表2 β-TCP仿生骨支架大體形態(tài)指標和生物力學強度

圖3 使用萬能力學試驗機(AG-2000A，島津公司，日本)以載荷速度0.5 mm/min、最大壓力2 000 N對β-TCP仿生骨支架進行力學測試 A 放置樣品，測試應(yīng)力 B 抗壓強度實時檢測 C 樣品抗壓應(yīng)力-應(yīng)變曲線 D 第一主應(yīng)力作用分布云圖

討 論

廣泛創(chuàng)傷、腫瘤、感染或先天性肌肉骨骼疾病等可能造成嚴重的骨缺損，植入生物材料修復骨缺損并促進骨再生是目前臨床研究的熱點。骨缺損愈合是一個骨組織重建的過程，通常需要經(jīng)過一個有重疊時間線的多維過程。骨有再生能力，絕大多數(shù)骨缺損在適宜的生理環(huán)境條件下可自發(fā)愈合。然而，骨缺損的愈合過程是一個耗時的過程，由于骨折部位供血減少，鈣磷對新骨的強化和硬化作用不足，新骨生成緩慢。此外，由于受到缺損較大或不穩(wěn)定的生物力學特性、不利的傷口環(huán)境、不理想的手術(shù)技術(shù)、代謝水平低、激素和營養(yǎng)水平不足以及所施加的壓力不當?shù)纫蛩氐挠绊?，大缺損(關(guān)鍵性骨缺損)可能不會自發(fā)愈合并導致骨不連[13]。

骨移植或骨替代生物材料植入是臨床骨外科修復大段骨缺損常用的治療策略。盡管自體骨移植是目前骨缺損的金標準治療方法，但它仍然存在一些缺點，如供體供應(yīng)受限、供區(qū)疼痛或出血等。同種異體骨移植方法的主要缺點是存在免疫介導的排斥反應(yīng)風險、傳染病傳播以及對移植體力學和生物學特性的負面影響。為了克服骨移植治療骨缺損的局限性，在過去幾十年中，越來越多的學者關(guān)注并研究由天然衍生和(或)合成材料制成的骨替代生物材料。理想的人工骨支架應(yīng)當具備以下特點：適合的三維多孔結(jié)構(gòu)；較高的孔隙率和連通性；較好的機械強度和降解性，不妨礙新生骨的生長與重建；無或低的免疫原性、組織相容性好；價格適中，易于制備等。目前大部分多孔生物材料不具備以上特點，不利于骨再生。有研究結(jié)果表明，骨組織工程材料β-TCP有非常好的生物相容性，可有效促進和誘導骨組織再生，較高的降解率也有顯著優(yōu)勢[14-15]。

3D打印技術(shù)不需要機械加工和模具，能夠直接根據(jù)計算機圖形數(shù)據(jù)快速制作任何形狀的物體，尤其適用于設(shè)計和制造結(jié)構(gòu)不規(guī)則且不均質(zhì)的人工骨支架。這一獨特的優(yōu)勢使3D打印技術(shù)在骨組織工程材料方面有著更廣闊的應(yīng)用空間[16-17]。

目前，實驗兔是肌肉骨骼相關(guān)研究中首選的模型動物[18]。與其他物種相比，兔與人在骨密度和骨干中段骨的斷裂韌性方面有相似之處，具有更快的骨骼變化和骨轉(zhuǎn)換過程，符合比較和評價骨替代品的成骨性能和特點的要求[19-20]。近年來，兔股骨遠端骨缺損模型已被研究者普遍用于測試新的骨替代生物材料[21-23]。Barbeck等[24]使用直徑7～10 mm臨界尺寸的圓柱形骨缺損兔模型成功研究了可注射磷酸鈣骨替代物在骨再生中的應(yīng)用。在進行人體臨床試驗之前應(yīng)用兔股骨遠端缺損模型測試替代生物材料具有建設(shè)性意義。

本實驗研究采用3D打印技術(shù)制備實驗兔股骨的β-TCP仿生骨支架。通過電子顯微鏡觀察到所制備的β-TCP仿生骨支架表面及內(nèi)部與實驗兔股骨相似，仿生骨小梁交錯連接，中間孔隙相連通，大孔周圍布滿小微孔，結(jié)構(gòu)直徑和連通孔道的孔徑都與設(shè)計參數(shù)相同，內(nèi)部具有較好的貫通結(jié)構(gòu)，與實驗兔股骨形態(tài)結(jié)構(gòu)匹配，無明顯收縮形變,抗壓強度在松質(zhì)骨抗壓強度區(qū)域值(2～12 MPa)之內(nèi)[25]。本研究實驗組與對照組在術(shù)后4、8、12周兔股骨骨缺損處新生骨細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義，表明實驗所構(gòu)建的β-TCP仿生骨支架利于細胞附著和微血管長入，利于新骨生成與重建。其中術(shù)后8、12周兩組數(shù)據(jù)差異更為顯著，同時組織切片顯示支架開始降解，周圍未見明顯炎性反應(yīng)，表明β-TCP仿生骨支架對于實驗兔機體組織無明顯細胞毒性。有研究結(jié)果顯示， β-TCP仿生骨支架在實驗兔體內(nèi)的降解時間為3～6個月，與松質(zhì)骨缺損的修復時間相當，在修復骨缺損的過程中植入材料的降解與成骨達到了較好的匹配。β-TCP在降解過程中產(chǎn)生鈣和磷等離子，可為新骨的形成提供所需要的物質(zhì)成分，同時其代謝產(chǎn)生的弱堿性離子可以提高內(nèi)環(huán)境的pH值，降低酸

圖4 實驗組與對照組兔股骨骨缺損部位組織學觀察結(jié)果 A～F 分別為對照組術(shù)后4、8、12周骨缺損處組織光學顯微鏡下像(標尺分別為400、100μm)，術(shù)后4周缺損處出現(xiàn)纖維組織及脂肪細胞，周邊有少量骨細胞，術(shù)后8周和12周骨缺損處出現(xiàn)較多新生纖維組織及脂肪細胞，周邊出現(xiàn)新生骨細胞，及少量骨小梁向缺損中部生長 G～L 分別為實驗組術(shù)后4、8、12周骨缺損處組織光學顯微鏡下像(顯示標尺分別為400、100μm)，術(shù)后4周時骨缺損處支架周邊孔徑內(nèi)出現(xiàn)新生骨及纖維組織，支架有少許降解，術(shù)后8周和12周時支架處逐漸出現(xiàn)鈣化的板層骨和較厚較粗的新生骨小梁(黃色箭頭所示)，新生骨組織與支架緊密貼附，支架部分已降解性環(huán)境下發(fā)生炎性反應(yīng)的概率。β-TCP在骨組織工程材料中將占有非常重要的位置[26-27]。

圖5 實驗組兔股骨髁修復處大體標本 A 術(shù)后第4周兔股骨髁缺損處已有少量填充 B 術(shù)后第8周兔股骨髁缺損處由新生骨組織大部分填充 C 術(shù)后第12周兔股骨髁缺損處已由新生骨組織完全填充

表3 實驗組與對照組兔股骨骨缺損部位術(shù)后Lane-Sandhu組織學評分

綜上所述：應(yīng)用3D打印技術(shù)制備兔股骨β-TCP仿生骨支架，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與兔股骨解剖形態(tài)相似，且具有良好的骨引導作用和生物力學性能；β-TCP是一種較為理想的骨缺損修復材料；現(xiàn)階段尚缺乏能很好地模擬骨缺損修復臨床條件的理想動物模型；如何更精準地調(diào)控β-TCP仿生骨支架的結(jié)構(gòu)、機械強度和生物相容性以及β-TCP仿生骨支架的臨床應(yīng)用將是我們進一步研究的方向。