肖美芳 陸 喆 陳柳英 陳 芬

（海南省婦女兒童醫(yī)學中心， 海南 海口570206）

宮頸癌是常見的惡性腫瘤，在全球女性中其發(fā)病率僅次于乳腺癌，居于第2 位，對婦女的健康有著重要的影響［1］。近年來，宮頸癌的發(fā)病機理及治療手段受到了廣泛的關注，2016 年世界衛(wèi)生組織公布，全球每年宮頸癌新發(fā)病例超過47 萬。宮頸癌的死亡率較高，在中國每年新發(fā)病例超過13 萬，其中死亡約5.3 萬，且死亡率仍呈上升趨勢［2］。木犀草素（Luteotin） 是一種天然的黃酮類化合物，具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化和抗癌［3-4］。本研究探討了木犀草素對宮頸癌Hela 細胞的增殖和凋亡的作用，以及其相關信號通路。

1 材料

1.1 細胞株 Hela 細胞株購于普如汀生物技術（北京）有限公司。

1.2 藥物與試劑木犀草素（純度為98%，批號20180112） 購自大連美侖生物技術公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號64017510）、胎牛血清（批號1616626） 購自美國Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號SHBB5 172 V） 購自美國Sigma 公司；AG490（批號20170524）、MTT（批號20180121） 購自北京索萊寶科技有限公司；JAK2 抗體（貨號ab108596，批號GR171114-1）、p-JAK2 抗 體（貨 號ab32101，批號 GR171514-2 ）、STAT3 抗 體（貨 號ab119352，批號 GR171514-2）、p-STAT3 抗 體（貨 號ab76315，批號GR161326-2）、BAX 抗體（貨號ab32503，批號GR88385-2）、BCL-2 抗 體（貨 號ab185002，批號GR161516-2），辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG（H ＋L）（貨號ab205718，批號GR84261-1） 均購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP，美國Bio-Rad 公司）；水平搖床（WD-9405B，北京六一儀器有限公司）；轉移槽（DYCZ-40D，北京六一儀器有限公司）；雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（HF-90，上海力申科學儀器有限公）；酶標儀（ELX-800，美國Bio-Tek 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela 細胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清和1% 鏈霉素和青霉素雙抗液DMEM 培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 天用胰酶消化，進行傳代。

2.2 藥物處理 將對數(shù)生長期Hela 細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入10、20、30、40 μmol／L 木犀草素或DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)上述實驗，分組為對照組、木犀草素10 μmol／L組、木犀草素20 μmol／L組、木犀草素30 μmol／L組、木犀草素40 μmol／L組。根據(jù)木犀草素對Hela 細胞增殖和凋亡影響的結果，選擇最適木犀草素濃度進行后續(xù)實驗。選用JAK2 抑制劑AG490（40 μmol／L）處理Hela 細胞，培養(yǎng)24 h 后，進行后續(xù)實驗。

2.3 Western blot 檢測 收集各組Hela 細胞于離心管中，加入RIPA 裂解液，電動勻漿器進行裂解，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。上樣量為20 μg 蛋白質，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉印至PVDF 膜上，用PBS 清洗PVDF 膜5 min，加入5%脫脂奶粉封閉1 h。加入JAK2抗體（1∶2 000）、p-JAK2 抗體（1∶2 500）、STAT3 抗體（1∶2 000）、p-STAT3 抗體（1∶2 500）、Bax 抗體（1∶2 000）、Bcl-2 抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜。加入二抗（1∶2 500），37℃孵育1 h。二抗孵育后使用ECL 發(fā)光液處理，在暗室中進行曝光拍照。每組實驗重復3 次。

2.4 MTT 檢測 96 孔板每孔加入合適數(shù)量的細胞，藥物處理24 h，將藥物處理后的各組細胞的培養(yǎng)液移除并用PBS 清洗3 次。各組細胞中添加5 mg／mL MTT，并在37℃培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)液，加入200 μL DMSO 溶液來溶解沉淀。酶標儀測定各組Hela 細胞在490 nm 處OD。每組實驗重復5 次。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將藥物處理后的各組Hela細胞充分消化，PBS 清洗，收集至流式管。利用Binding Buffer（500 μL） 重懸細胞，并加入Annexin V-FITC（5 μL）輕輕混勻，隨后加入Propidium Iodide（10 μL） 染料處理細胞，室溫條件下避光孵育15 min。細胞經(jīng)流式細胞儀進行檢測。每組實驗重復6 次。

2.6 統(tǒng)計學分析 利用Graphpad Prism 6 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析及數(shù)據(jù)作圖。數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用方差分析。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 木犀草素對宮頸癌Hela 細胞增殖的影響 MTT 檢測發(fā)現(xiàn)，木犀草素（30、40 μmol／L） 處理24 h 后可抑制Hela 細胞的增殖（P＜0.01），呈劑量依賴性；且40 μmol／L木犀草素處理Hela 細胞的存活率最低，見圖1。

圖1 不同濃度木犀草素對Hela 細胞增殖的影響

3.2 木犀草素對Hela 細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，對照組Hela 細胞凋亡率是4.2%，10、20、30、40 μmol／L 木犀草素處理24 h 后，Hela 細胞凋亡率分別是5.9%、11.5%、18.7%、24%；與對照組比較，木犀草素（30、40 μmol／L） 可以促進Hela 細胞凋亡（P＜0.01），見圖2。結合40 μmol／L 木犀草素對Hela 細胞增殖的調控作用，選擇40 μmol／L 木犀草素處理細胞，進行后續(xù)實驗。

3.3 木犀草素抑制Hela 細胞JAK2、STAT3 磷酸化激活 Western blot 結果顯示，40 μmol／L 木犀草素處理24 h后，Hela 細胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達降低；JAK2 抑制劑AG490（40 μmol／L） 處理24 h 后，Hela 細胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達也降低；當木犀草素與AG490 共同處理Hela 細胞后，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達更低，見圖3。提示，在Hela 細胞中，木犀草素可抑制JAK2、STAT3 磷酸化激活。

3.4 木犀草素通過JAK2／STAT3 信號通路調控Hela 細胞的增殖和凋亡 經(jīng)40 μmol／L 木犀草素、JAK2 抑制劑AG490處理Hela 細胞24 h 后，Hela 細胞增殖受到抑制（P＜0.01），Bax 蛋白表達增加，Bcl-2 蛋白表達下降；當木犀草素與AG490 共同處理Hela 細胞后，Hela 細胞增殖抑制作用更強，Bax 蛋白表達更高，Bcl-2 蛋白表達更低。見圖4。

4 討論

宮頸癌是全球第二常見的女性癌癥，每年導致260 000位女性死亡［5］。近年來，對宮頸癌的病因、治療手段的研究已成為熱點。侵襲轉移是宮頸癌治療過程中難以攻克的問題之一。

圖3 木犀草素對Hela 細胞p-JAK2、p-STAT3 表達的影響

目前，黃酮類化合物治療宮頸癌細胞侵襲已有部分研究［6-7］，但其內在機制尚需進一步研究。木犀草素作為黃酮類化合物家族中的一員，廣泛存在于各種水果和蔬菜中，已被證實有多種藥理功能，包括抗氧化、抗惡性細胞增殖［8-10］。研究［6］表明，木犀草素可以通過逆轉上皮-間質轉化（EMT） 信號，抑制宮頸癌細胞的侵襲能力。木犀草素可與腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL） 協(xié)同作用，促進宮頸癌Hela 細胞凋亡［11］。盡管如此，木犀草素在治療宮頸癌中的作用和機制尚未完全明確。劉鑫鑫等［12］研究表明木犀草素對宮頸癌Hela 細胞的增殖具有抑制作用，細胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)，但具體機制并未進行深入研究。

STAT3 作為JAK／STAT 信號通路中重要的信號分子，具有介導多種細胞因子的作用，在腫瘤組織和細胞中其呈高水平激活狀態(tài)，進而對腫瘤細胞的增殖和凋亡等過程具有關鍵的調控作用［13］。有研究［14］表明，木犀草素在多種癌細胞中通過激活JAK1／STAT1／2 信號通路來調控干擾素α／β 發(fā)揮抗腫瘤增殖作用。然而，多個研究表明木犀草素可以抑制STAT3 的信號激活調控多種癌細胞的增殖和凋亡，如胰腺癌細胞［15］、胃癌細胞［16］、肺腺癌［17］等。目前，已有多個研究表明，宮頸癌的治療過程中，抑制STAT3 信號通路，有效抑制宮頸癌細胞的增殖，促進宮頸癌細胞的凋亡［18］。目前，木犀草素在宮頸癌細胞中的調控是否通過JAK2／STAT3 信號通路尚未有研究。

在本研究中，探究了木犀草素對宮頸癌Hela 細胞的增殖能力及凋亡的影響及其潛在作用機制。木犀草素處理Hela 細胞24 h，木犀草素顯著抑制Hela 細胞的增殖，與劉鑫鑫等［12］研究結果一致，同時證明木犀草素顯著促進Hela細胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴 性。本實驗中，p-JAK2、p-STAT3在Hela 細胞中呈高表達，JAK2 特異性抑制劑AG490 顯著抑制p-JAK2、p-STAT3 的表達，且AG490 處理可以抑制Hela 細胞的增殖，促進Hela 細胞的凋亡，說明Hela 細胞的增殖及凋亡受JAK2／STAT3 信號通路的調控。對比AG490 處理組，木犀草素與AG490 共同處理Hela 細胞，對Hela 細胞增殖能力及凋亡調控更加顯著。實驗結果表明木犀草素在宮頸癌Hela 細胞中抑制JAK2／STAT3 信號通路，進而調控Hela 細胞的增殖及凋亡。

圖4 木犀草素通過JAK2／STAT3 信號通路調控Hela 細胞的增殖和凋亡

綜上所述，本研究證明了木犀草素通過調控JAK2／STAT3 信號通路的激活，抑制宮頸癌Hela 細胞增殖，促進宮頸癌Hela 細胞凋亡。