孔令華，夏小樂*，辛瑜*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

黃酒(Chinese rice wine)是以稻米、小麥等為主要原料，經(jīng)浸米、蒸煮、糖化發(fā)酵、壓榨過濾、煎酒、陳釀等步驟釀造而成的中國傳統(tǒng)發(fā)酵酒精飲料[1]。其中甜型黃酒是指含糖量>100 g/L的黃酒，其口味鮮甜醇厚，香氣濃郁。陳釀時(shí)間是評(píng)價(jià)黃酒質(zhì)量高低的重要指標(biāo)[2]，新酒經(jīng)過陳釀不斷發(fā)生物理和化學(xué)反應(yīng)。由于黃酒中含有豐富的還原糖[3]、氨基酸[4]等物質(zhì)，新酒中羰基化合物和氨基化合物在常溫條件下不斷進(jìn)行美拉德反應(yīng)，并產(chǎn)生大量美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，一方面增加了黃酒的色澤和風(fēng)味[5-6]，另一方面很多美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，例如5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)、糠醛和丙烯酰胺[7]等，具有一定的神經(jīng)毒性和遺傳毒性[8-9]。

通常新鮮果汁中5-HMF不超過10 mg/L[7]，歐盟規(guī)定蜂蜜中的最大限量為40 mg/kg[8]；在酒精飲料中，例如威士忌和朗姆酒中5-HMF質(zhì)量濃度達(dá)到40～50 mg/L[9]；在干李子及其飲品、咖啡粉、可可粉等食品中5-HMF質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可超過500 mg/kg[10]。新鮮食用的食品/飲品中5-HMF主要來源于熱處理加工[11-14]，而黃酒中5-HMF是在較長的儲(chǔ)存過程中產(chǎn)生的，當(dāng)黃酒中5-HMF含量過高且攝入過多會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響。這些具有安全風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)在一定程度上影響了黃酒的發(fā)展。

本文研究了甜型黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的含量變化，結(jié)合甜型黃酒中主要成分的含量變化(還原糖、氨基態(tài)氮、總酸及pH值等)，并通過甜型黃酒模擬體系設(shè)置各因素(理化指標(biāo))與5-HMF形成的關(guān)系，揭示了5-羥甲基糠醛在甜型黃酒陳釀過程中的生成規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

陳釀黃酒樣品，江蘇和浙江地區(qū)3個(gè)酒廠(B、G、Z)提供的陳釀甜型黃酒，樣品具體信息如表1所示。

5-羥甲基糠醛(5-HMF)標(biāo)準(zhǔn)品，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；DNS試劑，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(HPLC級(jí))、葡萄糖、氨基酸(Gly, Ala,Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Asp, Glu, Lys, Met, Ser, Thr,Cys, Pro, His, Arg)、無水乙醇、乳酸、NaOH、甲醛等，中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HITACHI chromaster高效液相色譜儀，日本日立公司；Agilent分析色譜柱Eclipse Plus C18250 mm×4.6 mm(5 μm)，美國安捷倫公司；Enspire多標(biāo)記檢測系統(tǒng)(酶標(biāo)儀)，珀金埃爾默有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AS220.R2電子天平，波蘭RADWAG Wagi Elektroniczne公司；FE28pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SB-4200DT超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

表1 取樣甜型黃酒基本信息Table 1 Basic information of sampling sweet Chinese rice wine

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酒中理化指標(biāo)的檢測

還原糖測定采用DNS法[15]；pH、總酸、氨基態(tài)氮的測定參照GB/T 13662—2018《黃酒》[16]。

1.2.2 5-羥甲基糠醛(5-HMF)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.037 29 g 5-HMF 標(biāo)準(zhǔn)品, 用5%甲醇水溶液溶解后定容至100 mL, 制得0.372 9 mg/L 的5-HMF 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，并用5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.2.3 樣品的前處理及5-羥甲基糠醛(5-HMF)檢測方法

將黃酒樣品用5%甲醇水溶液稀釋至相應(yīng)濃度，使用0.45 μm纖維素濾膜過濾后進(jìn)樣。

使用高效液相色譜法檢測黃酒中5-HMF[17]。將20 μL樣品注入Agilent Eclipse Plus C18分析色譜柱進(jìn)行色譜分離，使用甲醇和超純水進(jìn)行等度梯度洗脫(體積比5∶95)； 在30 ℃以1.0 mL/min的流速進(jìn)行檢測，在284 nm記錄色譜圖來進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。樣品中的5-HMF含量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.2.4 甜型黃酒模擬體系的構(gòu)建

配置質(zhì)量濃度為200 g/L葡萄糖溶液母液，20 g/L混合氨基酸溶液母液(17種氨基酸等比混合)，12 g/L乳酸溶液母液。因素條件(葡萄糖、氨基酸、乳酸)為分別添加該因素質(zhì)量濃度不同的工作液，其余因素添加濃度條件固定，其中固定濃度條件分別為葡萄糖質(zhì)量濃度100 g/L、氨基酸質(zhì)量濃度3 g/L、乳酸質(zhì)量濃度6 g/L，之后使用15%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水溶液定容；因素條件(pH值)為添加上述相同固定濃度條件，使用15%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水溶液定容，之后調(diào)節(jié)pH至相應(yīng)梯度。

將所有樣品置于90 ℃、1 h水浴加熱，結(jié)束后立即冷卻至室溫。樣品按1.2.3進(jìn)行5-HMF的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行平行重復(fù)3次。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用Orgin 2016、Adobe Illustrator和 SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、方差分析和作圖。Pearson檢驗(yàn)用于確定平均值之間差異的顯著性，P>0.05表示無顯著性差異，0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒中5-羥甲基糠醛的含量

2.1.1 5-羥甲基糠醛檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以5-羥甲基糠醛的峰面積與其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=483 793x+9 107.6，R2=0.999 3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其質(zhì)量濃度與峰面積之間存在良好的線性關(guān)系。

2.1.2 黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的含量

從甜型黃酒在陳釀過程中5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量變化(圖1)來看，在常溫條件下，隨時(shí)間增加美拉德反應(yīng)不斷進(jìn)行，甜型黃酒中5-HMF含量從初始較低到呈指數(shù)增加，且后期增長趨勢變緩。從地域上看，其中酒廠G(浙江地區(qū))中5-HMF的整體含量較高，其5-HMF的質(zhì)量濃度在新酒中為15.35 mg/L，8年陳釀后達(dá)到565.40 mg/L，可能和其傳統(tǒng)型發(fā)酵工藝積累較多還原糖和氨基態(tài)氮以及酒體酸度相對(duì)較高有關(guān)。而酒廠B、Z(江蘇地區(qū))8年陳釀后5-HMF質(zhì)量濃度分別達(dá)到516.56和401.70 mg/L，可能和江蘇地區(qū)黃酒大多為清爽型工藝，黃酒中糖分、氨基態(tài)氮含量及總酸含量都較低有關(guān)。

圖1 甜型黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的質(zhì)量濃度
Fig.1 Content of 5-hydroxymethylfurfural during the aging process of sweet Chinese rice wine

2.2 甜型黃酒中理化指標(biāo)的含量

2.2.1 甜型黃酒中還原糖及氨基態(tài)氮含量

5-HMF的生成途徑主要有2條，一條為還原糖和氨基酸之間的美拉德反應(yīng)[12]，另一條為還原糖高溫條件下直接裂解[18]，例如果糖可以在強(qiáng)酸性干燥條件下脫水得到。而在黃酒中5-HMF主要來源于美拉德反應(yīng)，即醛糖和氨基化合物經(jīng)反應(yīng)生成N-糖基胺，之后經(jīng)過Amadori重排生成重排產(chǎn)物，在酸性條件下(pH≤7)生成5-HMF。

由圖2可知，在甜型黃酒陳釀過程中還原糖含量和氨基態(tài)氮含量都在不斷提高，還原糖含量增加一方面主要是由于在黃酒酸性作用下淀粉糊化后逐漸轉(zhuǎn)化成葡萄糖，另一方面在長時(shí)間儲(chǔ)存過程中液體的蒸發(fā)致使還原糖的濃度有所增加；而黃酒中氨基態(tài)氮的不斷升高是由于在黃酒陳釀過程中蛋白質(zhì)會(huì)逐漸被分解為多肽和氨基酸。由此印證了2.1中酒廠G甜型黃酒中5-HMF的含量相對(duì)較高是由于其還原糖和氨基態(tài)氮含量相對(duì)較高。

所以甜型黃酒中5-HMF含量的逐年增加，一方面是由于隨時(shí)間增加美拉德反應(yīng)不斷進(jìn)行，另一方面是由于還原糖和氨基態(tài)氮不斷提高從而為5-HMF提供底物。

a-還原糖質(zhì)量濃度;b-氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度
圖2 甜型黃酒陳釀過程中還原糖及氨基態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化
Fig.2 Changes of reducing sugar and amino nitrogen content during the aging of sweet Chinese rice wine

2.2.2 甜型黃酒中pH、總酸含量

5-HMF是美拉德反應(yīng)在酸性條件下形成，由于陳釀過程中黃酒中醇酸類不斷酯化以及少量有機(jī)酸的揮發(fā)，如圖3所示，在甜型黃酒陳釀過程中黃酒的總酸含量都降低了0.3～1 g/L，相應(yīng)的pH值略微升高了0.05～0.2，雖然pH值在3.5～4.0仍促進(jìn)5-HMF的生成，這可能是甜型黃酒在1年陳釀后5-HMF增長速度減慢的一個(gè)原因。

a-pH值;b-總酸質(zhì)量濃度
圖3 甜型黃酒陳釀過程中pH值、總酸質(zhì)量濃度的變化
Fig.3 Changes of pH,total acid content during the aging of sweet Chinese rice wine

2.3 甜型黃酒中5-羥甲基糠醛的含量與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

在探究了3個(gè)酒廠甜型黃酒中5-HMF含量及其黃酒中主要成分的含量變化后，可以看出3個(gè)酒廠之間只存在含量差異但變化規(guī)律相似，故將3個(gè)酒廠的5-HMF含量及理化指標(biāo)含量平均值作相關(guān)性分析，如圖4所示，5-HMF與所有理化指標(biāo)都呈顯著相關(guān)，其中5-HMF與還原糖含量和氨基態(tài)氮含量在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，而5-HMF 與pH和總酸含量在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，證明在甜型黃酒中還原糖和氨基態(tài)氮作為反應(yīng)底物，低pH值與酸性條件作為反應(yīng)條件都是影響5-HMF含量的重要因素。

圖4 甜型黃酒中5-HMF的含量與理化指標(biāo)含量的 相關(guān)性
Fig.4 Correlation between 5-HMF and physicochemical parameters in sweet Chinese rice wine
注：**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*表示在 0.05 水平 (雙側(cè))上顯著相關(guān)

2.4 甜型黃酒模擬體系中5-羥甲基糠醛的含量與各影響因素的關(guān)系

2.4.1 葡萄糖含量及氨基酸含量與5-HMF生成的關(guān)系

在甜型黃酒中總糖一般以葡萄糖含量計(jì)[14]，使用葡萄糖作為甜型黃酒模擬體系的還原糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以葡萄糖的濃度與5-HMF含量進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為y=3.737 6x-37.618，R2=0.994 4，如圖5-a所示，葡萄糖含量和5-HMF生成呈良好的線性相關(guān)。也就是說黃酒的甜度越高時(shí)，其5-HMF的含量越多。另外當(dāng)葡萄糖不存在時(shí)，此時(shí)模擬體系中不生成5-HMF，進(jìn)一步證實(shí)還原糖(葡萄糖)是甜型黃酒中生成5-HMF的必要因素。

氨基態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，使用游離氨基酸含量表示氨基態(tài)氮含量。由圖5-b可知在模擬體系中少量添加氨基酸后，隨著氨基酸濃度的增加5-HMF的含量也隨之增加，這時(shí)由于氨基酸含量的不斷增加和葡萄糖反應(yīng)生成5-HMF。當(dāng)添加氨基酸質(zhì)量濃度超過8 g/L，5-HMF的含量明顯下降，此時(shí)體系中過量氨基酸又和5-HMF繼續(xù)美拉德反應(yīng)從而降低了其含量，也就是說氨基酸不是甜型黃酒中生成5-HMF的必要因素，但甜型黃酒中存在的氨基態(tài)氮的含量(2.2.1)影響著其5-HMF的含量，可以和還原糖不斷反應(yīng)生成5-HMF。

a-葡萄糖;b-氨基酸
圖5 甜型黃酒模擬體系中5-HMF質(zhì)量濃度與 葡萄糖濃度和氨基酸質(zhì)量濃度的變化
Fig.5 Changes of 5-HMF, glucose and amino acid concentration in sweet Chinese rice wine simulation

2.4.2 pH值、總酸含量與5-HMF生成的關(guān)系

如圖6-a所示，在美拉德反應(yīng)的甜型黃酒模擬體系中，當(dāng)pH≤7時(shí)會(huì)生成5-HMF，尤其是當(dāng)pH<3時(shí)含5-HMF會(huì)劇烈生成，在pH=1時(shí)體系產(chǎn)生的5-HMF量達(dá)到了1 393 μg/L，是pH=7時(shí)體系中5-HMF含量的116倍。由2.2.2得到甜型黃酒中的pH在3～4，此時(shí)的甜型黃酒也是促進(jìn)5-HMF生成的體系。而當(dāng)pH>7時(shí)不生成5-HMF，此時(shí)醛糖和氨基化合物反應(yīng)生成的Amadori重排物在堿性條件下生成醇醛類物質(zhì)等其他美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

在黃酒中總酸含量一般以乳酸含量計(jì)[14]。隨著乳酸含量的增加，模擬體系中5-HMF含量隨之逐漸增加，如圖6-b所示，當(dāng)外加乳酸的含量為0 g/L時(shí)，此時(shí)體系仍然有5-HMF的生成，可能因?yàn)榇藭r(shí)體系pH值依然為酸性(pH<6)，如圖6-c所示。當(dāng)乳酸含量不斷增加時(shí)，體系的pH值也在不斷降低，從而不斷促進(jìn)體系中5-HMF的生成。所以總酸含量對(duì)5-HMF積累的作用是通過改變體系pH值來影響5-HMF的含量。

綜上所述，在甜型黃酒體系中pH值是影響5-HMF生成的必要因素，尤其在極低pH值時(shí)非常有利于5-HMF的生成。

a-pH值；b-乳酸；c-不同乳酸質(zhì)量濃度下pH值
圖6 甜型黃酒模擬體系中5-HMF質(zhì)量濃度與pH值和總酸質(zhì)量濃度的變化以及不同總酸質(zhì)量濃度下的pH值
Fig.6 Changes of 5-HMF,pH value and lactic acid content in sweet Chinese rice wine simulation system and pH value under different lactic acid content

3 結(jié)論

其他新鮮食品中5-HMF主要來源于熱處理過程，在甜型黃酒生產(chǎn)工藝中煎酒時(shí)間較短且溫度相對(duì)熱處理食品較低，甚至有些甜型黃酒由于含糖量高且酒精度高不需要煎酒殺菌處理，所以其5-HMF含量主要是常溫長時(shí)間儲(chǔ)存產(chǎn)生的。在甜型黃酒陳釀過程中，5-HMF含量隨著陳釀時(shí)間增加而逐年增加，同時(shí)黃酒中還原糖和氨基態(tài)氮的含量也在緩慢增加，并由甜型黃酒模擬體系實(shí)驗(yàn)證實(shí)還原糖對(duì)于5-HMF生成的必要作用和氨基酸的存在對(duì)5-HMF生成的影響作用，即在甜型黃酒陳釀過程中可以為5-HMF的生成源源不斷提供底物。5-HMF是美拉德反應(yīng)在酸性條件下形成的，由模擬體系實(shí)驗(yàn)得到5-HMF在pH值越低時(shí)越容易生成，而在甜型黃酒陳釀過程中總酸含量略減少，相應(yīng)pH值在升高，可能是在甜型黃酒陳釀后期5-HMF含量的增長速度減慢的原因。

綜上所述，甜型黃酒中還原糖、氨基態(tài)氮含量、總酸含量及pH值是影響甜型黃酒中5-HMF生成的因素，其中必需的因素是還原糖和酸性條件。在甜型黃酒中較高的葡萄糖含量和黃酒本身酸性體系是5-HMF含量較高的主要原因，加之長時(shí)間的儲(chǔ)存更使甜型黃酒中5-HMF不斷積累。當(dāng)5-HMF攝入量過高時(shí)，會(huì)對(duì)人體健康有風(fēng)險(xiǎn)，所以一方面需要消費(fèi)者控制自身飲用量，另一方面可以采取一些調(diào)控措施[17,19-20]來適當(dāng)控制其含量。