孟圓圓，劉麗莉，楊曉盼，代曉凝，陳珂

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,食品加工與安全國(guó)家級(jí)教學(xué)示范中心,河南 洛陽(yáng)，471023)

沙門氏菌是一種在自然界中普遍存在，能在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)寄生并引起人畜共患病和食物中毒，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物生命健康的革蘭氏陰性致病菌[1]。已知沙門氏菌有2 600多個(gè)血清型，具有菌種種類多、分布廣且具有地域性、危害大等特點(diǎn)[2]，該菌的傳播媒介主要通過(guò)畜禽肉(尤其是雞肉)、禽蛋、奶及海產(chǎn)品等營(yíng)養(yǎng)豐富的食物進(jìn)行傳播，極易污染水源，每年由其所引起的細(xì)菌性食物中毒事件約占其他食源性病原菌的40%，在我國(guó)乃至世界全球范圍內(nèi)一直高居首位[3]。

目前，用于檢測(cè)沙門氏菌的方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法[4]。作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的傳統(tǒng)培養(yǎng)法，需要進(jìn)行前增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定等處理，雖結(jié)果可靠性強(qiáng)，但操作步驟繁瑣復(fù)雜且耗時(shí)耗力，一般需要4～7 d才能得出檢測(cè)結(jié)果[5]。分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[6]、基因芯片技術(shù)[7]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[8]、生物傳感器技術(shù)[9]等具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及技術(shù)人員要求較高且成本昂貴，難以在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)及在基層普及[10]；免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附法[11]、免疫磁珠分離法[12]、免疫試紙條法[13]等雖重現(xiàn)性較好，但檢出限較高且易交叉污染，檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象[14]?；谝陨蠙z測(cè)方法都存在不足之處，因此，開發(fā)一種快速、高效、靈敏度高且特異性強(qiáng)的沙門氏菌檢測(cè)方法具有重要意義。

近年來(lái)，利用熒光標(biāo)記與磁性納米材料相結(jié)合的方法檢測(cè)細(xì)菌因具有檢測(cè)周期短、靈敏度及準(zhǔn)確度高而成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。如車玉蘭[15]分別對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記并與易操控的納米磁富集結(jié)合，建立了檢測(cè)細(xì)菌的高效分析方法及微流控芯片法。LI等[16]建立了一種不同磁性梯度的熒光-磁性納米探針快速分離和檢測(cè)多種病原菌的方法。YU等[17]利用基于磁性Fe3O4納米粒子和雜交鏈反應(yīng)的熒光級(jí)聯(lián)放大法檢測(cè)沙門氏菌，在生菜中檢出限可達(dá)6.9×102CFU/g。HU等[18]實(shí)驗(yàn)采用比色-熒光-磁性納米球的多模式平臺(tái)檢測(cè)沙門氏菌。以上研究主要基于磁性納米粒子與熒光標(biāo)記相結(jié)合的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，但利用Fe3O4/GO納米復(fù)合材料與熒光標(biāo)記DNA相結(jié)合用于檢測(cè)沙門氏菌的報(bào)道還未出現(xiàn)。

本文通過(guò)化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4/GO，F(xiàn)e3O4/GO除具有順磁性外，還具備熒光猝滅作用及對(duì)單鏈DNA強(qiáng)烈的吸附能力，本研究充分利用Fe3O4/GO和熒光標(biāo)記DNA探針的優(yōu)點(diǎn)，采用熒光標(biāo)記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術(shù)對(duì)沙門氏菌目標(biāo)DNA的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，對(duì)人工模擬污染雞肉樣品中的沙門氏菌進(jìn)行了檢測(cè)，得出沙門氏菌菌落總數(shù)對(duì)數(shù)與相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0之間的定量關(guān)系，建立快速、選擇性好、靈敏度高且特異性強(qiáng)的沙門氏菌檢測(cè)新方法，旨在為沙門氏菌的檢測(cè)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化石墨烯，南京先豐納米材料科技有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl(分析純)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；NaCl(分析純)，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；胰蛋白胨、酵母浸膏(生化試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；FeCl3、FeCl2，天津市福晨化學(xué)試劑廠；氨水(分析純)，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司；沙門氏菌(ATCC 14028)、大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003),微生物實(shí)驗(yàn)室老師友情饋贈(zèng)；所有DNA序列,均由上海生工生物工程股份有限公司合成；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DY04-13-44-00型壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；THZ-1038型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DH-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；BBS-V800型潔凈工作臺(tái)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；BE-1100型四維旋轉(zhuǎn)混勻器，海門市其林貝爾儀器有限公司； KQ2200型超聲波清洗儀，昆山市超聲波清洗儀；35172 BRUZ型拍擊式均質(zhì)機(jī)，法國(guó)AES Chemuex公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Cary eclpise型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司；

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Fe3O4/GO的制備

參考劉闖[19]的方法并改進(jìn)。采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4/GO，分別取2 g FeCl3和1 g FeCl2加入到100 mL滅菌超純水中，超聲處理2 h得溶液A；取 0.3 g GO加入到100 mL滅菌超純水中，超聲處理4 h得溶液B；將以上2種溶液進(jìn)行混合，同時(shí)加入30%氨水將溶液pH調(diào)整為9～10，置于水浴鍋中加熱到90 ℃，同時(shí)攪拌至混合物顏色完全變黑，將其從水浴鍋中取出自然冷卻到室溫，然后放入離心機(jī)中離心得到黑色固體，用滅菌超純水和無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次至混合物上清液的pH為7左右，再將黑色固體置于 70 ℃的真空干燥箱中烘干，即可制得Fe3O4/GO。

1.3.2 DNA序列設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用軟件Primer Premier 5.0對(duì)3條DNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并用Ribosomal Database Project Ⅱ和NCBI Blast 2數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Probe Match軟件檢測(cè)序列的特異性[5, 20]。設(shè)計(jì)的DNA序列如表1所示。

表1 探針堿基序列Table 1 Probe base sequence

1.3.3 沙門氏菌目標(biāo)DNA檢測(cè)條件的優(yōu)化

分別考察Fe3O4/GO質(zhì)量濃度(4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4、2.4×10-4、2.8×10-4、3.2×10-4、3.6×10-4g/mL)、Fe3O4/GO與捕獲探針?lè)磻?yīng)時(shí)間(0、3、9、21、24、27、42、60、80、100 min)及反應(yīng)溫度(31、34、37、40、43 ℃)對(duì)熒光猝滅作用的影響?？疾霥NA探針雜交時(shí)間(30、60、90、120、150 min)和富集倍數(shù)(1、3、5、7、9倍)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.4 沙門氏菌目標(biāo)DNA的檢測(cè)

將Fe3O4/GO與捕獲探針在最優(yōu)條件下進(jìn)行反應(yīng)，得到Fe3O4/GO捕獲探針復(fù)合物溶液，磁分離收集磁性顆粒，移除原溶液，并用PBS緩沖液清洗磁性顆粒以除去未反應(yīng)的DNA。然后吸取PBS緩沖液配置的一系列濃度的沙門氏菌目標(biāo)DNA溶液，以滅菌超純水代替沙門氏菌目標(biāo)DNA溶液為空白對(duì)照，分別加入到磁性顆粒中，在42 ℃條件下反應(yīng)一定時(shí)間以完成部分雜交，然后置于磁場(chǎng)中磁分離10 min，收集磁性顆粒，移除原溶液，除去未反應(yīng)的DNA。再吸取用PBS緩沖液稀釋一定濃度的釋放探針溶液加入到磁性顆粒中，并進(jìn)行富集，在42 ℃條件下反應(yīng)2 h，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成雜交試驗(yàn)。完成雜交之后的DNA雙鏈將脫離Fe3O4/GO表面，熒光恢復(fù)，再利用磁場(chǎng)磁性分離Fe3O4/GO，并將上清液置于熒光石英比色皿中，在激發(fā)波長(zhǎng)為λex=495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=517 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10 nm條件下，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，并扣除自身熒光背景吸收，即可對(duì)沙門氏菌進(jìn)行定量分析。

1.3.5 沙門氏菌的培養(yǎng)

用移液搶吸取1 mL實(shí)驗(yàn)室保藏的沙門氏菌菌液于裝有50 mL 滅菌LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)搖床上振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使沙門氏菌菌種分散、活化，并用PBS溶液稀釋至10-1～10-9濃度備用[15]。

1.3.6 人工模擬污染雞肉中沙門氏菌DNA的提取與檢測(cè)

人工模擬沙門氏菌污染雞肉參考胡冰雪[21]的方法并加以改進(jìn)，在無(wú)菌條件下，分別取25 g冰鮮雞胸肉與225 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行混合，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中37 ℃均質(zhì)1 min，等量分裝成10份，在離心機(jī)中3 000 r/min離心5 min，懸浮液用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾后的肉湯置于-20 ℃條件下冷藏待用。

分別吸取上述稀釋菌液100 μL于滅菌沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)平板菌落劃線法算得沙門氏菌數(shù)量為2.8×107CFU/mL。用PBS溶液將沙門氏菌的數(shù)量稀釋為1.0×101～1.0×107CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌液，將所稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌液分別加入到25 mL肉湯中，對(duì)照組中加入滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[21-22]。再向以上每份肉湯中加入25 mL滅菌后的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，搖勻后置于37 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱150 r/min振蕩24 h，吸取1 mL各濃度梯度的菌液用GenerayTMBiotechnology公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(GK1072)提取沙門氏菌的DNA，并置于95 ℃水浴鍋中5 min，然后在0 ℃條件下冰浴5 min，以打開雙鏈，制備出單鏈DNA作為沙門氏菌目標(biāo)DNA[22]，利用熒光標(biāo)記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術(shù)對(duì)人工模擬污染雞肉中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，得出其最低檢出限及沙門氏菌菌落總數(shù)對(duì)數(shù)與相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0之間的定量關(guān)系，以此來(lái)判斷本方法的準(zhǔn)確性和可行性。

1.3.7 特異性分析

為考察所建立檢測(cè)方法的特異性，以沙門氏菌為實(shí)驗(yàn)組，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對(duì)照組，利用試劑盒提取其DNA，并進(jìn)行熒光測(cè)定。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，且所有的熒光光譜圖均扣除其背景吸收，采用ChemDraw 18.0軟件繪制示意圖及Origin 8.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

當(dāng)向Fe3O4/GO溶液中加入捕獲探針溶液時(shí)，由于捕獲探針單鏈DNA堿基上的C-N雜環(huán)與Fe3O4/GO碳六環(huán)結(jié)構(gòu)之間存在π-π堆積及靜電引力作用而吸附在Fe3O4/GO表面，此時(shí)，標(biāo)記在捕獲探針一端的6′-FAM熒光素能與Fe3O4/GO之間發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移生成復(fù)合物而導(dǎo)致熒光猝滅，如圖1-(a)所示。然后通過(guò)磁分離收集磁性顆粒，移除原溶液，除去未反應(yīng)的DNA，再加入沙門氏菌目標(biāo)DNA溶液，沙門氏菌目標(biāo)DNA與捕獲探針的一段DNA進(jìn)行雜交形成部分雙鏈并脫離Fe3O4/GO表面，如圖1-(b)所示。再次進(jìn)行磁分離收集磁性顆粒，移除原溶液，除去未反應(yīng)的DNA，并向磁性顆粒中加入釋放探針溶液，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成雜交形成完整的DNA雙鏈并脫離Fe3O4/GO表面，熒光恢復(fù)，利用磁場(chǎng)分離Fe3O4/GO，通過(guò)檢測(cè)上清液熒光強(qiáng)度的變化即可實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的快速檢測(cè)，如圖1-(c)所示。

圖1 基于熒光標(biāo)記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術(shù)檢測(cè) 沙門氏菌DNA的示意圖
Fig.1 Schematic diagram of rapid detection ofSalmonellatarget DNA based on fluorescently labeled DNA-magnetic graphene oxide magnetic separation technology

2.2 沙門氏菌目標(biāo)DNA檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1 Fe3O4/GO質(zhì)量濃度的優(yōu)化

由圖2可知，在未加入Fe3O4/GO之前，沙門氏菌捕獲探針在495 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，其熒光發(fā)射峰在517 nm處，當(dāng)沙門氏菌捕獲探針濃度為50 nmol/L時(shí)，扣除Fe3O4/GO的背景吸收后，其熒光強(qiáng)度 ΔF=944.92(ΔF=F-FT，其中F為加入沙門氏菌捕獲探針時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)T為未加入沙門氏菌捕獲探針時(shí)的熒光強(qiáng)度)，固定沙門氏菌捕獲探針濃度不變，當(dāng)向其溶液中加入不同質(zhì)量濃度的Fe3O4/GO后，沙門氏菌捕獲探針的熒光被猝滅，且隨著Fe3O4/GO質(zhì)量濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸減小，熒光猝滅率逐漸增大，當(dāng)Fe3O4/GO濃度為3.2×10-4g/mL時(shí)，熒光猝滅率可達(dá)96.86%，表明Fe3O4/GO對(duì)沙門氏菌捕獲探針有強(qiáng)烈的熒光猝滅作用。

a-不同質(zhì)量濃度Fe3O4/GO的熒光猝滅光譜圖; b-不同質(zhì)量濃度Fe3O4/GO的熒光猝滅率圖
圖2 不同質(zhì)量濃度Fe3O4/GO的熒光猝滅光譜圖 及熒光猝滅率圖
Fig.2 Fluorescence quenching spectrum and fluorescence quenching rate of different mass concentrations of Fe3O4/GO

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間及溫度對(duì)熒光猝滅作用的影響

由圖3-a可知，反應(yīng)時(shí)間在0～21 min時(shí)，其熒光強(qiáng)度迅速減小，熒光猝滅強(qiáng)度迅速增加，反應(yīng)時(shí)間在60～100 min時(shí)，熒光強(qiáng)度幾乎不變，因此Fe3O4/GO與沙門氏菌捕獲探針最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖3-b為反應(yīng)溫度對(duì)熒光猝滅作用的影響圖，隨著反應(yīng)溫度的增加，其熒光強(qiáng)度先減小后增加，即熒光猝滅強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)溫度為37 ℃時(shí)，熒光猝滅強(qiáng)度最大，反應(yīng)溫度為43 ℃時(shí)，熒光猝滅強(qiáng)度最小，說(shuō)明反應(yīng)溫度的升高，不利于Fe3O4/GO與沙門氏菌捕獲探針形成復(fù)合物，因此，F(xiàn)e3O4/GO與沙門氏菌捕獲探針最佳反應(yīng)溫度為37 ℃。

a-反應(yīng)時(shí)間;b-反應(yīng)溫度
圖3 反應(yīng)時(shí)間及溫度對(duì)熒光猝滅作用的影響
Fig.3 Effect of reaction time and temperature on fluorescence quenching

2.2.3 雜交時(shí)間的優(yōu)化

雜交時(shí)間決定著DNA分子之間是否完全雜交，是影響雜交反應(yīng)的因素之一[20]。本實(shí)驗(yàn)將1 pmol/L 沙門氏菌目標(biāo)DNA與Fe3O4/GO捕獲探針復(fù)合物在42 ℃條件下進(jìn)行雜交，分別考察雜交時(shí)間30、60、90、120、150 min對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在30～120 min，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間>120 min時(shí)，熒光強(qiáng)度幾乎不變，空白對(duì)照組中的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的增加保持相對(duì)恒定，則最佳雜交時(shí)間為120 min。

圖4 雜交時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響
Fig.4 Effect of hybridization time on fluorescence intensity

2.2.4 富集倍數(shù)的優(yōu)化

若待測(cè)目標(biāo)物DNA含量過(guò)低，則很難對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，為保證Fe3O4/GO能將待測(cè)目標(biāo)物DNA捕獲并富集，通過(guò)對(duì)待測(cè)目標(biāo)物DNA進(jìn)行富集處理，可使熒光信號(hào)強(qiáng)度放大，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度[20]，故對(duì)富集倍數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了富集1、3、5、7和9倍5組不同富集倍數(shù)下的熒光強(qiáng)度。圖5為富集倍數(shù)隨熒光強(qiáng)度及相對(duì)熒光強(qiáng)度變化的折線圖。由圖5-a可知，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度均隨富集倍數(shù)的增加而增加，而空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度增加較緩慢，其原因可能是待測(cè)液體積隨富集倍數(shù)的增加而減少，導(dǎo)致背景熒光物質(zhì)的濃度增加，所檢測(cè)的空白對(duì)照組中的熒光強(qiáng)度也隨之增加[20]。由圖5-b可知，相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0(F為實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度)隨富集倍數(shù)的增加先增大后逐漸減小，富集5倍時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0最大。因此，F(xiàn)e3O4/GO對(duì)待測(cè)目標(biāo)物DNA的最優(yōu)富集倍數(shù)為5倍。

a-熒光強(qiáng)度隨富集倍數(shù)的變化; b-相對(duì)熒光強(qiáng)度隨富集倍數(shù)的變化
圖5 熒光強(qiáng)度及相對(duì)熒光強(qiáng)度隨富集倍數(shù)的變化
Fig.5 Fluorescence intensity and relative fluorescence intensity as a function of enrichment factor

2.2.5 沙門氏菌目標(biāo)DNA的檢測(cè)分析

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，分別檢測(cè)了不同濃度下的沙門氏菌目標(biāo)DNA的熒光強(qiáng)度，圖6-a為不同濃度沙門氏菌目標(biāo)DNA的熒光光譜圖，熒光強(qiáng)度隨沙門氏菌目標(biāo)DNA濃度的增加而增加；由圖6-b可知，熒光強(qiáng)度與沙門氏菌目標(biāo)DNA濃度在0.005～1 pmol/L呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程y=7.065 9x+2.614 7，R2=0.998 1(x為沙門氏菌目標(biāo)DNA濃度，y為相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0)，檢出下限為5 fmol/L(S/N=3)[23]。11次重復(fù)0.01 pmol/L沙門氏菌目標(biāo)DNA濃度來(lái)評(píng)價(jià)該方法的精密度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%，說(shuō)明所建立的檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和精密度。

a-不同濃度目標(biāo)DNA的熒光光譜圖;b-目標(biāo)DNA濃度與 熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖
圖6 不同濃度目標(biāo)DNA的熒光光譜圖和目標(biāo)DNA 濃度與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系圖
Fig.6 Fluorescence spectrum of target DNA at different concentrations and linear relationship between target DNA concentration and fluorescence intensity

2.3 雞肉樣品的檢測(cè)及樣本分析

2.3.1 雞肉樣品的檢測(cè)

取購(gòu)自超市的新鮮雞胸肉，按照1.3.6中的方法進(jìn)行預(yù)處理，以提取的沙門氏菌DNA為目標(biāo)DNA，利用所建立的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，將熒光分光光度計(jì)所測(cè)的熒光強(qiáng)度與沙門氏菌菌落總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，結(jié)果如圖7所示，沙門氏菌菌落總數(shù)在102～106CFU/mL時(shí)，菌落總數(shù)對(duì)數(shù)與相對(duì)熒光強(qiáng)度具有良好的相關(guān)性，回歸方程為y=0.700 4x+1.358 4，R2= 0.999 3(x為沙門氏菌總數(shù)對(duì)數(shù)，y為相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0)，檢出限為102CFU/mL(S/N=3)[23]。

圖7 相對(duì)熒光強(qiáng)度與菌落總數(shù)對(duì)數(shù)的線性關(guān)系
Fig.7 Linear relationship between relative fluorescence intensity and the total number of colonies

2.3.2 雞肉樣本分析

為了考察所建立檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可靠性，分別將PBS溶液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌液加入到雞肉樣本中并進(jìn)行預(yù)處理，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒分別提取不同雞肉樣本中沙門氏菌的DNA，在沙門氏菌目標(biāo)DNA最優(yōu)檢測(cè)條件下，對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，將相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0帶入2.3.1中的回歸方程即可計(jì)算出其檢測(cè)值，以實(shí)際檢測(cè)沙門氏菌的數(shù)量與添加沙門氏菌數(shù)量的比值計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果如表2所示，該方法在雞肉樣品中的加標(biāo)回收率為96.8%～105.6%，RSD<4.52%，在不添加沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌液的雞肉樣本中未檢測(cè)到沙門氏菌。結(jié)果表明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際雞肉樣本中沙門氏菌的檢測(cè)。

表2 雞肉樣本的回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of determination of recovery rate of chicken samples

注：-表示無(wú)

2.4 特異性檢測(cè)

為了驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，用DNA提取試劑盒分別提取沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的DNA，在相同條件下，分別對(duì)其進(jìn)行熒光測(cè)定，并扣除其背景吸收，結(jié)果如圖8所示，沙門氏菌DNA具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，大腸桿菌的熒光強(qiáng)度與金黃色葡萄球菌的熒光強(qiáng)度相接近，且明顯低于沙門氏菌DNA的熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明所建立檢測(cè)沙門氏菌的方法特異性好且具有良好的選擇性[15]。

圖8 本方法對(duì)沙門氏菌檢測(cè)的特異型分析
Fig.8 Analysis of the specificity of this method forSalmonelladetection

2.5 本方法與其他檢測(cè)方法的比較

為了研究所建立檢測(cè)沙門氏菌方法的優(yōu)越性，將該方法與文獻(xiàn)中其他檢測(cè)沙門氏菌的方法進(jìn)行了對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如表3所示，該檢測(cè)方法具有較低的檢出限和較短的檢測(cè)時(shí)間，檢出限決定了檢測(cè)方法的精密程度，因此，該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的快速檢測(cè)。

表3 本方法與其他文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)沙門氏菌方法的比較Table 3 Comparison of this method with other methods for detecting Salmonella

3 結(jié)論

本研究利用Fe3O4/GO能將帶有熒光標(biāo)記的單鏈捕獲探針吸附在其表面并使其熒光猝滅，基于雜交互補(bǔ)反應(yīng)，捕獲探針?lè)謩e與先后加入體系的沙門氏菌目標(biāo)DNA和釋放探針完成雜交，并從Fe3O4/GO表面釋放出來(lái)，熒光恢復(fù)，利用磁場(chǎng)分離Fe3O4/GO，通過(guò)檢測(cè)上清液熒光強(qiáng)度即可實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌DNA的高靈敏檢測(cè)。所建立的熒光標(biāo)記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術(shù)快速檢測(cè)雞肉中沙門氏菌的方法與其他檢測(cè)方法相比，該方法具有較低的檢出限和較短的檢測(cè)時(shí)間，能夠?qū)崿F(xiàn)沙門氏菌的快速、高靈敏度和特異性檢測(cè)，對(duì)其他致病菌的檢測(cè)具有指導(dǎo)意義。