韓 悅，刁玉剛，宋丹丹，孫瑩杰，費(fèi)婉琪，鄭晶晶

體外循環(huán)（extracorporeal circulation，ECC）技術(shù)目前已經(jīng)成為心胸外科手術(shù)的重要輔助措施，但體外循環(huán)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的心臟手術(shù)其術(shù)后死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生率仍較高，一直是相關(guān)研究的重點(diǎn)。因此建立模擬臨床ECC過(guò)程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@得尤為重要。本研究擬對(duì)大鼠ECC模型建立的相關(guān)穿刺技術(shù)進(jìn)行改良，探索大鼠ECC模型安全簡(jiǎn)便有效的建立方法。

1 研究對(duì)象及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體重在350～400 g的成年雄性SD大鼠20只，大鼠由中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，所有實(shí)驗(yàn)方法均由中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和確認(rèn)（批準(zhǔn)號(hào)2019014）。

1.2 材料與試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)（玉研科學(xué)儀器公司，HX-101E），多參數(shù)心電監(jiān)護(hù)儀（康泰醫(yī)學(xué)系統(tǒng)有限公司，CMS7000），血?dú)夥治鰞x（德國(guó)西門子），Morris水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），16 G、18 G、22 G和24 G套管穿刺針（碧迪醫(yī)療器械有限公司），以及整個(gè)大鼠ECC系統(tǒng)，由恒流蠕動(dòng)泵（重

慶科耐普蠕動(dòng)泵有限公司）、大鼠專用模式氧合器（四川華西生物科研所）、配套硅膠泵管及管道（上海復(fù)旦生物材料有限公司）組成；戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司）、吸入用七氟烷（上海恒瑞醫(yī)藥）、鹽酸利多卡因注射液（遂成藥業(yè)股份有限公司）等藥物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麻醉與術(shù)前準(zhǔn)備 大鼠在溫度 23～25℃，濕度 45%～55%，光暗周期 12 h／12 h 環(huán)境中飼養(yǎng)［1］。術(shù)前禁食6 h、不禁水。腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg／kg，待大鼠翻正反射消失后固定于手術(shù)臺(tái)上，連接心電圖和血氧監(jiān)測(cè)，大鼠氣管插管，連接呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸參數(shù)：潮氣量8～10 ml／kg，呼吸頻率 60次／min，吸入純氧流量 1 ～ 2.5 L／min［2］。 根據(jù)動(dòng)脈血?dú)庹{(diào)整參數(shù)使動(dòng)脈二氧化碳分壓（PaCO2）維持在35～45 mm Hg，術(shù)中根據(jù)麻醉深度進(jìn)行2%戊巴比妥鈉 0.3～0.5 ml間斷腹腔注射。

1.3.2 穿刺置管 右側(cè)頸部、雙下肢大腿內(nèi)側(cè)術(shù)區(qū)備皮，消毒，鋪單。切皮后用2%利多卡因0.5 ml局部浸潤(rùn)麻醉，依次鈍性分離左側(cè)大隱靜脈，隱動(dòng)脈，右側(cè)隱動(dòng)脈及右側(cè)頸內(nèi)靜脈，血管上下兩端分別穿1-0絲線打活結(jié)備用，置管完成后可直接打結(jié)進(jìn)行置管固定。左側(cè)大隱靜脈以24 G套管針穿刺置管，排氣，給予肝素（400 IU／kg）進(jìn)行全身肝素化，10 min后測(cè)活化凝血時(shí)間（activated clotting time，ACT），確保轉(zhuǎn)流期間的 ACT＞480 s，此靜脈用于靜脈給藥及補(bǔ)液。左側(cè)隱動(dòng)脈置入24 G套管，連接換能器檢測(cè)血壓及采血。將24 G套管針置入右側(cè)隱動(dòng)脈作為ECC動(dòng)脈血回輸端。右頸內(nèi)靜脈置入帶有側(cè)孔的18 G套管針，置管深度到門齒，插入上腔靜脈和下腔靜脈與右心房交界處，作為靜脈引流端［3］。

1.3.3 ECC 預(yù)充液為6%羥乙基淀粉注射液2 ml，乳酸鈉林格注射液2 ml，20%甘露醇1 ml，5%碳酸氫鈉+呋塞米+肝素（1 000 IU／kg）共1 ml成比例配置備用。儲(chǔ)血槽為5 ml注射器并低于大鼠心臟平面30 cm，連接并固定轉(zhuǎn)流機(jī)各管道，連接氧氣端，流量調(diào)至 1～2.5 ml／min，0.9%生理鹽水排空管道并探查管道連接緊密性，用預(yù)充液沖洗管道并排空膜肺及管道內(nèi)氣泡，防止氣泡進(jìn)入大鼠體內(nèi)［4］。5 ml儲(chǔ)血槽內(nèi)加入羅庫(kù)溴銨 1.2 ml／kg，舒芬太尼 3 μg／kg，去甲腎上腺素2滴（2 ml注射器針頭）。膜肺動(dòng)脈出血口連接右側(cè)隱動(dòng)脈，儲(chǔ)血槽接收頸內(nèi)靜脈引流出的血流，轉(zhuǎn)流開(kāi)始逐漸加大引流量至100～120 ml／（kg·min），關(guān)閉呼吸機(jī)，ECC 期間根據(jù)血?dú)饨Y(jié)果調(diào)整各離子水平以及酸堿失衡，大鼠的各指標(biāo)與人的正常值范圍相同，保持體溫32～35℃，監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)流期間的尿量，維持平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）60～90 mm Hg。 轉(zhuǎn)流 60 min逐漸減少灌注流量至1 ml／h，恢復(fù)機(jī)械通氣。根據(jù)停機(jī)前血紅蛋白及血細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）決定是否回輸管道內(nèi)的血。停機(jī)前按1∶1給予魚精蛋白拮抗肝素。根據(jù)大鼠血壓及中心靜脈壓調(diào)整血管活性藥及補(bǔ)液，待其生命體征平穩(wěn)后停藥，拔出穿刺針套管，結(jié)扎，局麻下縫合。

1.3.4 術(shù)后 待大鼠自主呼吸恢復(fù)并有體動(dòng)后，脫機(jī)觀察其呼吸情況，撤掉心電監(jiān)護(hù)，保留血氧飽和度監(jiān)測(cè)繼續(xù)觀察，待大鼠自主脫管，自由進(jìn)水，自由活動(dòng)后放入飼養(yǎng)箱中，供食水，注意通風(fēng)，保暖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 19.0軟件，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠存活情況 18只大鼠順利完成ECC，另兩只因穿刺頸內(nèi)靜脈置管失敗導(dǎo)致引流不暢以及穿破心臟而死亡。完成ECC的大鼠待循環(huán)穩(wěn)定后拔出動(dòng)靜脈插管并在局麻下縫合切口皮膚，等大鼠自主吐出氣管導(dǎo)管，喂食糖水待其狀態(tài)良好后放回鼠籠，術(shù)后24 h觀察大鼠活動(dòng)情況及精神狀態(tài)與術(shù)前無(wú)異樣，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠穿刺部位以及術(shù)后下肢恢復(fù)情況

2.2 生命體征與血?dú)夥治鼋Y(jié)果 大鼠ECC期間MAP與肛溫明顯降低，但在ECC結(jié)束后會(huì)逐漸恢復(fù)，由于預(yù)充液的血液稀釋HCT在ECC期間也有所降低，但在可接受的范圍內(nèi)，其余參數(shù)基本維持在正常水平。見(jiàn)表1。

2.3 大鼠術(shù)后1 d水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 18只大鼠術(shù)后1 d均進(jìn)行隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，所有大鼠術(shù)前和術(shù)后的平均游泳速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明改良后的穿刺技術(shù)對(duì)大鼠術(shù)后下肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)無(wú)明顯影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 大鼠ECC模型循環(huán)及血?dú)庾兓╪＝18，±s）

項(xiàng)目 ECC前 ECC 15 min ECC 45 min 停ECC ECC后30 min MAP（mm Hg） 110.3±5.7 65.8±6.3 64.2±6.7 92.4±7.4 97.6±6.8肛溫（℃） 37.1±0.4 34.5±0.7 35.1±0.6 35.5±0.7 36.8±0.3 HCT 0.43±0.06 0.30±0.03 0.30±0.02 0.3±0.03 0.34±0.02 PaO2（mm Hg） 378±36.6 252±21.3 246±25.4 236±22.5 382±37.2 PaCO2（mm Hg） 38.3±2.1 36.7±1.2 37.4±0.9 38.0±1.4 40.1±1.8

圖2 大鼠術(shù)前術(shù)后平均游泳速度的比較

3 討 論

ECC是心臟手術(shù)成功的前提和保證，大鼠ECC模型的建立模仿臨床設(shè)置，能夠應(yīng)用于ECC術(shù)后所致并發(fā)癥相關(guān)機(jī)制的具體研究。本論文總結(jié)國(guó)內(nèi)外大鼠ECC模型的建立并結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)及條件進(jìn)行了改良。

3.1 麻醉與插管 麻醉與插管是ECC模型成功建立的前提，此模型待大鼠七氟烷吸入麻醉后采用2%戊巴比妥鈉50 mg／kg提起右下肢完全暴露腹部進(jìn)行腹腔注射麻醉，注意回吸無(wú)血后注射麻藥，避免麻藥入血死亡，待翻正反射消失后，四肢及門齒固定在手術(shù)臺(tái)上，營(yíng)造黑暗的環(huán)境，打開(kāi)手術(shù)燈探照在聲門位置，插管鉗挑起會(huì)厭后，可見(jiàn)聲門隨呼吸運(yùn)動(dòng)而張合，插管切勿暴力，抓好時(shí)機(jī)，待聲門張開(kāi)后輕柔的置入氣管導(dǎo)管，并固定好導(dǎo)管位置連接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。多次插管會(huì)導(dǎo)致喉頭水腫充血，上呼吸道分泌物增多，大鼠因無(wú)法通氣血氧飽和度急劇下降而死亡，因此遇到插管困難時(shí)可換其他實(shí)驗(yàn)人員嘗試插管或者使用管芯將導(dǎo)管置入，保證大鼠及時(shí)通氣確保生命體征的平穩(wěn)。

3.2 動(dòng)靜脈穿刺置管 本實(shí)驗(yàn)采用了大隱靜脈及隱動(dòng)脈穿刺置管。右下肢隱動(dòng)脈分離穿刺置管作為動(dòng)脈回輸端，左下肢隱動(dòng)脈分離穿刺置管連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓以及大隱靜脈穿刺作為靜脈輸液給藥。本方法選擇右下肢隱動(dòng)脈而不是尾動(dòng)脈作為動(dòng)脈血回輸端，隱動(dòng)脈位置表淺，易于分離，且不易出血，并且術(shù)中可以妥善固定，不會(huì)因回輸血壓力大而使管路脫出，術(shù)后結(jié)扎隱動(dòng)脈及隱靜脈不會(huì)影響大鼠下肢血供，對(duì)下肢活動(dòng)無(wú)影響。為檢驗(yàn)采用這種穿刺方法建立的大鼠ECC模型對(duì)術(shù)后行為學(xué)檢測(cè)是否有影響，分別在術(shù)前和術(shù)后1 d進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，18只大鼠全部完成訓(xùn)練，因此這種改良穿刺方法建立的大鼠ECC模型，在大鼠ECC后檢測(cè)動(dòng)物行為學(xué)改變是可行的。

3.3 右頸內(nèi)靜脈穿刺置管注意事項(xiàng) 采用16 G麻醉套管針進(jìn)行穿刺，針管前端剪4-5個(gè)側(cè)孔，為了達(dá)到更好的引流。右頸內(nèi)靜脈血管壁較薄，穿刺過(guò)程中極易穿破血管壁，進(jìn)而血?dú)庑匦纬?，因此穿刺過(guò)程中，動(dòng)作要輕柔，遇到阻力后適當(dāng)調(diào)整角度方向重新進(jìn)管，置管深度到右心房并且血流速度能夠滿足全流量轉(zhuǎn)流即是合適的深度［5-6］，切勿繼續(xù)進(jìn)管，穿破心房導(dǎo)致心包壓塞大鼠血壓迅速下降至死亡。熟悉大鼠頸內(nèi)靜脈至右心房血管的走形及解剖結(jié)構(gòu)，操作要小心謹(jǐn)慎，盡量避免上述情況的發(fā)生。

3.4 ECC期間的調(diào)節(jié) 本模型為無(wú)血預(yù)充非開(kāi)胸心臟不停跳ECC模型，為了防止大鼠血液過(guò)度稀釋，盡量減少管路中的預(yù)充液，通過(guò)轉(zhuǎn)流前大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果，在預(yù)充液中加入相應(yīng)的藥物進(jìn)行預(yù)調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)采用的管路需要預(yù)充液12 ml左右，血流量調(diào)節(jié)在 100～120 ml／（kg·min）［7-8］。 轉(zhuǎn)流期間嚴(yán)密監(jiān)測(cè)大鼠血壓心率的波動(dòng)以及尿量體溫的數(shù)值，必要時(shí)給予升壓藥或強(qiáng)心藥處理。術(shù)中血?dú)夥治鲲@示HCT經(jīng)預(yù)充液稀釋后在0.28以上，血紅蛋白在86 g／L以上，能夠滿足器官組織灌注及攜氧能力。轉(zhuǎn)流期間注意儲(chǔ)血槽的血液平面不能低于1 ml，防止進(jìn)入氣體導(dǎo)致空氣栓塞，觀察尿量及顏色的改變，計(jì)算出入量，必要時(shí)補(bǔ)液或者給利尿藥，確保腎臟灌注。根據(jù)血?dú)庵嫡{(diào)節(jié)酸堿平衡，離子紊亂，及時(shí)糾正保持內(nèi)環(huán)境平衡。轉(zhuǎn)流1 h后停機(jī)要慢，注意復(fù)溫，根據(jù)血紅蛋白的濃度決定管路中的血是否輸回大鼠體內(nèi)，回輸血液轉(zhuǎn)流機(jī)減到最小轉(zhuǎn)速，防止速度過(guò)快引起心衰［9-10］。

綜上所述，大鼠ECC模型建立有很多種，本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠下肢隱靜脈、隱動(dòng)脈進(jìn)行穿刺，操作熟練后血管神經(jīng)解剖明確，操作時(shí)間明顯縮短，術(shù)中可以妥善固定，術(shù)后下肢恢復(fù)速度很快，創(chuàng)傷小，選擇穿刺的血管結(jié)扎后都有側(cè)支血管進(jìn)行血液供應(yīng)，不會(huì)造成缺血壞死的并發(fā)癥，為今后研究ECC后嚴(yán)重并發(fā)癥的病理機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。