張會強,白 昭,王 斐,張秦銘,馬文鵬,王雨薇
(1.陜西省環(huán)境監(jiān)測中心站,陜西 西安 710054;2.國家環(huán)境二噁英監(jiān)測西北分中心,陜西 西安 710054)
二噁英類物質(zhì)包括多氯二苯并二噁英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs),共計210種化合物。這類化合物通過進入動物細胞內(nèi)與芳香烴受體(AhR)結(jié)合,調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄,引發(fā)各種的毒性效應[1,2],包括致癌、致畸、致突變和生殖毒性效應[3~6]。隨著工業(yè)社會的發(fā)展,鋼鐵冶煉、垃圾焚燒、水泥生產(chǎn)、制漿造紙等行業(yè)排放產(chǎn)生的二噁英[7],蓄積在土壤、底泥等環(huán)境介質(zhì)當中,因其極難降解,隨食物鏈放大并富集在動物和人體當中,影響食品安全和人體健康[8~10]。
2016年5月28日國務院印發(fā)了《土壤污染防治行動計劃》,簡稱“土十條”,旨在加強土壤污染防治,保證土壤環(huán)境質(zhì)量,保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。土壤中的二噁英類的定量檢測主要依據(jù)HJ 77.4-2008《土壤和沉積物二噁英的測定同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法》(high resolution gas-high resolution mass spectrometer ,簡稱 HRGC-HRMS法)。該方法檢測過程繁瑣,成本高,周期長,需有昂貴的高分辨質(zhì)譜檢測,不適用于環(huán)境樣品的大量篩選。熒光素酶報告基因法(the chemical-activated luciferase expression,以下簡稱CALUX法)是將熒光素酶作為報告基因插入到控制轉(zhuǎn)錄的DRE基因下游,制備成報告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染大鼠肝癌細胞構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。含二噁英類的樣品與細胞株共同孵育時,就會激活AhR信號通路,進而激活含DRD(dioxin responsive domain, DRD)報告基因的啟動子,誘導熒光素酶的表達,加入熒光素酶底物產(chǎn)生熒光,熒光值與二噁英含量成正比[11]。CALUX法已經(jīng)成為行業(yè)內(nèi)二噁英快速篩選的“熱點”方法[12~14]。
對某生活垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤進行了布點采樣(1#~9#樣品,詳見圖1),采用快速溶劑萃取(ASE)進行樣品提取,硫酸酸洗和多層硅膠柱凈化,溶劑轉(zhuǎn)換為二甲基亞砜(DMSO)后,利用CALUX法測定了土壤樣品中的二噁英類。
(1)主要儀器設備,如表1所示。
(2)試劑與耗材。正己烷、二氯甲烷,色譜純,均為Fisher品牌;甲苯、濃硫酸、濃鹽酸,色譜純,均為德國merck品牌;無水硫酸鈉、氯化鈉、硅藻土、優(yōu)級純,均為德國merck品牌;酸性硅膠柱、堿性硅膠柱、活性炭柱均為FMS品牌;CALUX細胞株和CALUX-Aid軟件由美國XDSI公司授權使用;胎牛血清(FBS)、細胞培養(yǎng)用抗生素(Pen Strep簡稱P/S)、胰蛋白酶(Trypsin)、培養(yǎng)基(RPMI-1640)均為Gibco品牌;二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma品牌;細胞裂解液、熒光素酶試劑盒均為Promega品牌;2,3,7,8-TCDD(50μg·mL-1,DMSO溶劑)為Wellington品牌;30~300 μL八通道移液器,1-100 mL大容量電動移液器購自德國Sartorius品牌;XB-K-25型細胞計數(shù)板,購自上海求精生化試劑儀器有限公司;Mr.Frosty梯度降溫盒,Nunc 96孔底透微孔板,均購自美國ThermoFisher公司;2 mL凍存管,50 mL離心管,10 cm細胞培養(yǎng)皿均購自美國Corning公司;其它玻璃器皿為實驗室常用規(guī)格。
圖1 某垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤采樣布點
表1 主要儀器設備相關信息
2.2.1 樣品的預處理 稱取5.000g土壤樣品經(jīng)酸泡,過濾后,進行快速溶劑萃取,儀器條件:加熱溫度120℃,加熱時間6 min,靜態(tài)時間7 min,循環(huán)3次,清洗體積70%,吹氣時間200 s。提取液經(jīng)3次酸洗后用飽和氯化鈉溶液水洗,經(jīng)無水硫酸鈉干燥后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約5 mL。經(jīng)多層硅膠柱(酸性硅膠柱+堿性硅膠柱+活性炭柱)凈化后,用正己烷定容至10 mL,分取5 mL轉(zhuǎn)移到K-D管濃縮到1.0 mL,氮吹吹干,用200 μLDMSO定容,室溫避光保存。
2.2.2 細胞實驗 按照91% (RPMI-1640)+8%FBS+1%P/S的比例配制培養(yǎng)基。從-80℃超低溫冰箱取出含CALUX細胞株的凍存管, 37℃恒溫水浴快速解凍,吹打散后快速轉(zhuǎn)入10 cm細胞培養(yǎng)皿進行細胞復蘇。37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)至長滿90%培養(yǎng)皿后再進行細胞傳代。將重復傳代的細胞溶液1 000 rpm離心3 min后,加入培養(yǎng)基重懸。細胞計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞密度為7.5×105cells·mL-1,此溶液為細胞種板溶液。按照每孔200 μL的細胞混懸液的量接種96孔板,每個孔接種15萬個細胞,接種方式按照圖2進行。然后將接種好的底透板做好標記后進行培養(yǎng)。
將50μg·mL-12,3,7,8-TCDD用DMSO進行逐級稀釋,配制成下表2濃度值。對培養(yǎng)了14~24 h的96孔板進行細胞給藥,然后置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24 h。取出底透板,進行細胞裂解,于化學發(fā)光讀扳機上進行上機檢測,讀取熒光響應值(RLU)。
圖2 細胞種板布板方式
(備注:PBS表示磷酸鹽緩沖溶液;NC表示DMSO溶劑空白;STD1~STD9表示標準系列;QC表示質(zhì)控樣;1#~9#表示樣品。)
表2 標準曲線濃度
2.3.1 標準曲線結(jié)果 將上機檢測讀取標準物質(zhì)的RLU值代入CALUX-Aid軟件,得出圖3熒光值對2,3,7,8-TCDD標準溶液的響應曲線。
圖3 標準物質(zhì)的熒光響應曲線
2.3.2 實驗結(jié)果 將上機檢測讀取樣品的RLU值代入CALUX-Aid軟件,得出1#~9#農(nóng)田土壤樣品中的二噁英毒性當量濃度分別為7.05 ngTEQ·kg-1、7.95 ngTEQ·kg-1、6.20 ngTEQ·kg-1、14.16 ngTEQ·kg-1、8.42 ngTEQ·kg-1、4.06 ngTEQ·kg-1、7.07 ngTEQ·kg-1、4.93 ngTEQ·kg-1、3.50 ngTEQ·kg-1。NC樣品未檢出,QC結(jié)果在合格范圍內(nèi)。
2.3.3 結(jié)果討論 9個樣品均為某生活垃圾焚燒發(fā)電廠周邊農(nóng)田土壤,二噁英毒性當量濃度范圍為3.50~14.16 ngTEQ·kg-1。均值為7.04 ngTEQ·kg-1低于荷蘭和瑞士的農(nóng)田土壤標準(10ngTEQ·kg-1)[15]。由圖4可見點位與排放口的距離越遠,二噁英濃度越低。該廠所處地理位置常年主導方向為南風,其中4#、5#和7#均位于該廠北面,因此,濃度值略高,其中4#超出了10 ngTEQ·kg-1的農(nóng)田土壤標準限值。
圖4 二噁英毒性當量濃度與采樣點位距煙囪直線距離的關系
與HRGC-HRMS法相比,CALUX法檢驗結(jié)果僅能指示2,3,7,8-TCDD的毒性當量值,并不能給出樣品中二噁英組分的單體指紋特征及豐度,只能作為二噁英類快速篩選的半定量方法。但是,CALUX法利用哺乳動物細胞對二噁英進行暴露試驗,檢驗結(jié)果直接反映人體健康風險,同時可以實現(xiàn)對大量樣品的高通量檢驗,因此,CALUX法在實際應用中具有獨特的優(yōu)勢和意義。