吳佳雯 謝周鑒 譚學才 胡琪 雷福厚

摘?要?以甲基對硫磷為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，馬來松香丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，在石墨烯修飾的玻碳電極表面合成分子印跡聚合物膜，制備分子印跡電化學傳感器，用于檢測有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷。采用循環(huán)伏安法、微分脈沖伏安法、電化學交流阻抗法研究傳感器的電化學特性及分析特性。結(jié)果表明，在最佳檢測條件下，傳感器的峰電流與甲基對硫磷濃度在1.0×10?7～8.0×10?5 mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Ip （μA）=0.65199-0.02387C （μmol/L），相關(guān)系數(shù)R2為0.9922，檢出限為5.0×10?8 mol/L（S/N=3）。構(gòu)建了傳感器的動力學吸附模型，測得印跡傳感器的結(jié)合速率常數(shù)k=20.2758s。將此傳感器用于番茄樣品中甲基對硫磷的檢測，加標回收率為95.0%～100.3%。

關(guān)鍵詞?甲基對硫磷;石墨烯;分子印跡電化學傳感器;馬來松香丙烯酸乙二醇酯

1?引 言

甲基對硫磷（Methyl parathion，MP）是一種高毒致命的神經(jīng)毒劑[1，2]，因其防治蟲害高效快速，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[3，4]。MP較難降解，在環(huán)境中殘留期較長，對人體和環(huán)境安全存在危害[5]，如不慎被人或動物攝入，即使是低劑量，也會對其視覺系統(tǒng)、感覺功能和認知能力造成嚴重損害[6]。因此，建立準確靈敏的MP檢測方法具有重要意義。

目前，檢測MP的方法主要有氣相色譜法（GC）[7，8]、高效液相色譜法（HPLC）[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[10，11]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[12，13]、熒光傳感器法[4，5]、紫外分光光度法[14]、表面增強拉曼光譜法[15]和結(jié)合納米材料制備的電化學傳感器法[1～3]等。傳統(tǒng)的色譜法雖可準確靈敏地檢測MP，但所用儀器精密昂貴，檢測耗時，過程繁瑣復雜，且必須由專業(yè)技術(shù)人員進行操作;熒光傳感器易受環(huán)境因素干擾;紫外分光光度法易受光（電）源影響而產(chǎn)生較大誤差;表面增強拉曼光譜法需要制備高穩(wěn)定性高拉曼增強活性的基底材料。因此，有必要建立一種穩(wěn)定性高、制備簡單、成本低廉的MP檢測方法。

電化學方法具有靈敏度高，響應速度快等特點，在檢測農(nóng)藥、金屬離子、污染物等領(lǐng)域應用廣泛[16]。分子印跡電化學傳感器是建立在分子印跡聚合物的基礎(chǔ)上，將電化學方法與分子印跡技術(shù)相結(jié)合的傳感器。在共聚的過程中，模板分子與聚合物單體通過多重作用點聚合;去除模板分子后，聚合物中形成對模板分子具有特異性識別位點的空穴，這種空穴使得聚合物對模板分子具有特異性識別功能[17]。分子印跡電化學傳感器具有操作簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[18～22]。然而，分子印跡聚合物膜通常存在附著力差、電化學信號低等不足。納米材料具有特殊的理化性質(zhì)和較大的比表面積，可提高電子傳遞速率，放大電化學信號，結(jié)合納米材料制備分子印跡電化學傳感器可以很好地彌補分子印跡聚合物膜存在的不足[23，24]。石墨烯（Graphene，GR）是一種二維結(jié)構(gòu)的碳納米材料，具有良好的導電性和穩(wěn)定性，在制備電化學傳感器方面發(fā)展?jié)摿薮?。利用石墨烯制備電化學傳感器檢測各類物質(zhì)也是近年的研究熱點，如采用石墨烯制備電化學傳感器檢測抗壞血酸、多巴胺和尿酸[25]，采用石墨烯和單壁碳納米管復合材料制備印跡溶膠-凝膠電化學傳感器檢測沒食子酸丙酯[26]等。此外，結(jié)合石墨烯制備分子印跡電化學傳感器檢測甲基對硫磷也有相關(guān)文獻報道，如采用氮摻雜石墨烯制備分子印跡傳感器檢測甲基對硫磷[27]、采用離子液體-石墨烯復合材料制備分子印跡聚合物檢測甲基對硫磷[28]等。

本研究以有機磷農(nóng)藥MP為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，自合成的馬來松香丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，結(jié)合納米材料石墨烯制備了一種分子印跡電化學傳感器，并用于檢測MP。在分子印跡聚合物膜的制備過程中，交聯(lián)劑起固定聚合物空間骨架的作用。本研究采用的交聯(lián)劑馬來松香丙烯酸乙二醇酯由廣西特色資源松香改性制得，以其作為交聯(lián)劑具有機械性能良好、交聯(lián)度高和用量少等優(yōu)點[29，30]。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

PGSTAT128N電化學工作站（瑞士萬通公司）;DZF-6020真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）;采用三電極系統(tǒng)，玻碳電極GCE（φ=3.0 mm）為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極（φ=1.0 mm）為對電極。

甲基對硫磷、辛硫磷、毒死蜱、三唑磷（分析標準品，阿拉丁試劑有限公司）;伏殺磷（分析標準品，美國Accustandard公司）;單層石墨烯粉末（南京先豐納米材料科技有限公司）;甲基丙烯酸（分析純，阿拉丁試劑有限公司）;馬來松香丙烯酸乙二醇酯（自制[31]）。其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

2.2?石墨烯修飾電極的制備

將玻碳電極用0.05 μm Al2O3粉末拋光，然后依次用HNO3（1∶1，V/V）、無水乙醇和超純水超聲清洗5 min，待用。稱取5 mg 單層石墨烯粉末于小燒杯中，加入5 mL四氫呋喃，超聲30 min，使其充分混勻，制得石墨烯分散液（1 mg/mL）。取2 μL混勻的石墨烯分散液，滴涂在玻碳電極表面，將電極置于真空干燥箱（60℃）中1 h，使溶劑徹底揮發(fā)，制得石墨烯修飾電極（GR/GCE）。

2.3?印跡及非印跡電極的制備

取2 mL甲苯于小燒杯中，依次加入模板分子MP（0.1 mmol）、功能單體甲基丙烯酸（0.4 mmol）、交聯(lián)劑馬來松香丙烯酸乙二醇酯（0.4 mmol）和引發(fā)劑偶氮二異丁腈（0.0160 g），超聲使其混合均勻。將2 μL混合液滴涂到石墨烯修飾電極表面，靜置90 s，使混合液均勻成膜;將電極置于真空干燥箱（60℃）內(nèi)熱聚合5 h，制得未洗脫MP分子的印跡電極（nMIP/GR/GCE），將nMIP/GR/GCE置于乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液中60 s，洗脫MP分子，制得洗脫MP分子后的印跡電極（MIP/GR/GCE）;非印跡電極（NIP/GR/GCE）的制備，除不加模板分子MP外，其余步驟相同。

2.4?實際樣品的檢測

番茄樣品進行粉碎處理，準確稱取5.0 g番茄樣品，依次加入10 mL水、15 mL乙醇，搖晃使其完全混合均勻，離心6 min，取上清液，用檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH=7.0）定容至100 mL，制得番茄樣品溶液，采用本方法進行檢測，并進行加標回收實驗。

3?結(jié)果與討論

3.1?分子印跡膜的制備流程

MP分子印跡聚合物的制備過程如圖1所示。首先，MP和功能單體甲基丙烯酸通過氫鍵結(jié)合形成加合物;再加入交聯(lián)劑馬來松香丙烯酸乙二醇酯和引發(fā)劑偶氮二異丁腈，使MP和甲基丙烯酸聚合成交聯(lián)度較高的分子印跡聚合物;最后，用合適的方法去除MP，聚合物膜內(nèi)僅留下與MP結(jié)構(gòu)互補的“空穴”。

3.2?分子印跡膜的電化學表征

采用循環(huán)伏安法對分子印跡膜進行電化學表征。如圖2所示，GR/GCE （a）上的循環(huán)伏安電流響應大于裸電極GCE（b）上的電流響應，說明裸電極表面修飾石墨烯后，電子傳遞速率提高，因此電化學信號增大，體現(xiàn)了石墨烯良好的增敏作用;nMIP/GR/GCE（e）和NIP/GR/GCE（f）上幾乎沒有電化學響應，這是因為電極表面被一層致密且導電性差的分子印跡聚合物膜覆蓋，使得電子傳遞嚴重受阻;MIP/GR/GCE（c）上有一定的電流響應，這是因為洗脫了MP分子后，聚合物膜中留下了大量與MP空間結(jié)構(gòu)互補的“空穴”，電子可通過這些“空穴”進行傳遞，從而產(chǎn)生電流響應。將MIP/GR/GCE（c）在4.5× 10?6 mol/L MP溶液中進行孵育，在孵育后的MIP/GR/GCE（d）上的電流響應減小，說明MP分子重新吸附到聚合物膜中，填補了聚合物膜中的“空穴”。

采用電化學交流阻抗法考察電極表面的變化。圖3是不同電極的電化學交流阻抗圖，內(nèi)插圖是等效電路圖，其中，Rs是電解質(zhì)電阻，Cdl是電極表面的雙電層電容，Ret是電極表面的電子傳遞電阻。交流阻抗圖中高頻部分測得的半圓直徑大小對應于Ret的數(shù)值。對不同電極的交流阻抗圖進行數(shù)據(jù)分析，得到不同電極的Ret值：GR/GCE（a，3.39×102 Ω）、GCE（b，4.55×102 Ω）、MIP/GR/GCE（c，4.99×103 Ω）、孵育后的MIP/GR/GCE（d，6.54×103 Ω）、nMIP/GR/GCE（e，1.37×104Ω）、NIP/GR/GCE（f，1.11×104Ω）。GR/GCE表面的Ret值小于GCE，說明電極表面修飾石墨烯后，減小了電子傳遞阻力，更易進行電子傳遞;nMIP/GR/GCE和NIP/GR/GCE因表面被致密的聚合物膜覆蓋，電子傳遞阻力很大，因此Ret值相對較大;洗脫了MP分子后，電極的Ret值較洗脫前減小，說明印跡聚合物膜中留有大量印跡“空穴”，電子傳遞阻礙減小;孵育后的MIP/GR/GCE由于重新吸附了MP分子，減弱了電子傳遞速率，因此Ret值較孵育前增大。

3.3?實驗條件的優(yōu)化

影響分子印跡電化學傳感器分析性能的主要因素有洗脫溶劑和時間、支持電解質(zhì)、孵育時間等，因此，有必要對上述實驗條件進行優(yōu)化。

3.3.1?洗脫溶劑和時間的影響?甲醇的極性較大且浸透性好，作為模板洗脫溶劑，洗脫效率高于二氯甲烷和乙腈。在甲醇中添加適量乙酸可增加溶劑的洗脫作用力，破壞模板與聚合物之間的結(jié)合力，有效減少模板分子的滲漏，且乙酸-甲醇均溶于水，洗脫后用超純水沖洗電極可以很好地去除殘留在電極上的洗脫劑，因此，選擇乙酸-甲醇作為洗脫溶劑。洗脫溶劑的酸性過強，可能會破壞聚合物膜的空間結(jié)構(gòu)，影響對MP的識別效果，分別考察了乙酸-甲醇（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6，V/V）對MP的洗脫效果，結(jié)果表明，乙酸-甲醇（1∶9，V/V）中MP的洗脫效果最佳。將印跡電極置于乙酸-甲醇（1∶9，V/V）中洗脫MP，利用K3[Fe（CN）6]作電化學探針，進行微分脈沖伏安（DPV）掃描。如圖4所示，隨著洗脫時間延長，MP逐漸溶出，電極表面的“空穴”增多，DPV峰電流隨之增加，當洗脫時間大于60 s后，峰電流趨于穩(wěn)定，說明60 s后MP已經(jīng)洗脫完全，因此，選擇60 s作為最佳的洗脫時間。

3.3.2?支持電解質(zhì)的選擇?采用DPV法，考察了MIP/GR/GCE在檸檬酸-檸檬酸鈉、KCl、NH3·H2O-NH4Cl、HAc-NaAc、KH2PO4-K2HPO4（0.1 mol/L，pH=7.0）等電解質(zhì)溶液中的電化學響應。結(jié)果表明，在0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中，峰電流最大且峰形最佳。

考察了不同pH值（4.0～7.5）的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L）對K3[Fe（CN）6]?DPV峰電流的影響。如圖5所示，當支持電解質(zhì)的pH=7.0時，電流響應最大，因此，選擇檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH=7.0）作為最佳支持電解質(zhì)。

3.3.3?孵育時間的選擇?采用DPV法，考察了MIP/GR/GCE在4.5×10?6 mol/L MP溶液中孵育時間（0～150 s）對峰電流的影響。如圖6所示，在0～120 s，峰電流隨著孵育時間的延長而減小，孵育時間大于120 s后，電流響應趨于穩(wěn)定，說明此時 MIP/GR/GCE結(jié)合MP分子已達飽和。因此，選擇孵育時間為120 s。

3.4?分子印跡膜傳感器的電化學響應特征

3.4.1?線性范圍和檢出限?在最佳實驗條件下，采用DPV法考察了MIP/GR/GCE在不同濃度的MP溶液中的電化學響應。如圖7所示，傳感器的還原峰電流與MP的濃度在1.0 × 10?7～8.0 × 10?5 mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Ip（μA）=?0.65199-0.02387C （μmol/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.9922，檢出限為5.0 × 10?8 mol/L （S/N=3），低于國家標準（GB 23200.8-2016）[32]對甲基對硫磷的限量水平（1.65 × 10?7 mol/L）。與文獻報道的方法相比，本方法具有較寬的線性范圍和較低的檢出限（表1）。

3.4.2?分子印跡膜傳感器的選擇性

采用DPV法考察了MIP/GR/GCE的選擇性。選擇MP的結(jié)構(gòu)類似物（毒死蜱、三唑磷、辛硫磷、伏殺磷）進行測試。將MIP/GR/GCE分別置于MP、毒死蜱、三唑磷、辛硫磷、伏殺磷溶液中進行DPV掃描，MP溶液濃度為4.5×10?6 mol/L，結(jié)構(gòu)類似物溶液濃度均0.6-0.1 V 5mol/L。 如圖8所示，MP的電流響應明顯大于結(jié)構(gòu)類似物，毒死蜱、三唑磷、辛硫磷、伏殺磷的電流響應分別相當于MP電流響應的24.7%、20.1%、21.0%和18.8%。傳感器對MP電流響應較大是因為MIP/GR/GCE和MP發(fā)生特異性結(jié)合，而與結(jié)構(gòu)類似物主要是非特異性結(jié)合，因此，測得的電流響應較小，表明所研制的傳感器對MP具有較高的選擇性。

3.4.3?分子印跡膜傳感器動力學研究

圖9是MIP/GR/GCE和NIP/GR/GCE在4.5×10?6 mol/L MP溶液中吸附時間對傳感器峰電流變化值ΔIp的影響圖，利用Langmuir吸附模型，擬合上述兩種傳感器吸附MP的動力學曲線：

其中，t為吸附時間;ΔIp為t時刻傳感器吸附溶液中物質(zhì)的響應電流變化值;ΔIpm為吸附平衡時的響應電流變化值;k為動力學結(jié)合速率常數(shù)。

擬合參數(shù)見表2，MIP/GR/GCE的ΔIpm明顯大于NIP/GR/GCE，表明MIP/GR/GCE對MP的再結(jié)合量大于NIP/GR/GCE，這是由于MIP/GR/GCE內(nèi)存在可與MP結(jié)合的識別位點，而NIP/GR/GCE內(nèi)的結(jié)合位點較少，因而吸附量較小。

3.4.4?重現(xiàn)性和穩(wěn)定性?在最佳的實驗條件下，6 mol/L MP溶液中平行測定11次，RSD為2.7%;將5根相同條件下制備的MIP/GR/GCE置于4.5 × 10?6 mol/L MP溶液中進行檢測，RSD為3.4%，表明所制備的傳感器具有較好的重現(xiàn)性。將MIP/GR/GCE保存7天后，測得的電流響應值是初始響應的94.8%，說明傳感器穩(wěn)定性較好。

3.5?實際樣品分析

在最佳實驗條件下，采用本方法對番茄樣品檢測，番茄樣品中未檢出MP，加標回收實驗結(jié)果見表3，回收率在95.0%～100.3%范圍內(nèi)，RSD為1.9%～2.3%。因此，本方法可用于番茄樣品中甲基對硫磷的檢測。

4?結(jié) 論

研制了一種石墨烯增敏的分子印跡電化學傳感器，用于檢測有機磷農(nóng)藥MP。在分子印跡傳感器的制備中結(jié)合納米材料石墨烯，有效提高了傳感器的分析性能。此傳感器檢測快速、成本低廉且選擇性高，并成功應用于番茄樣品中MP的檢測，可作為一種新型的分子印跡電化學傳感器用于檢測實際樣品中的MP。

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