覃明娟 陳森林 趙強忠彭 琛 金保鋒 陶 紅

(1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640； 2. 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣東 廣州 510385)

微生物生長和代謝過程中可降解煙葉中的多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生酯類、酸類等致香小分子物質(zhì)，如十四酸甲酯、辛酸等[1]，可有效提高煙葉吸食品質(zhì)和縮短發(fā)酵時間。研究表明，鞘氨醇單細(xì)胞可降解煙葉中綠原酸及蕓香苷等多酚物質(zhì)，提高煙葉感官質(zhì)量[2]，食源性乳酸菌可明顯提高煙葉的抽吸品質(zhì)[3]。食品工業(yè)常用微生物有米曲霉、植物乳桿菌、黑曲霉，其中黑曲霉代謝產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及果膠酶，可有效降低上部煙葉中的淀粉和蛋白質(zhì)含量[4]；植物乳桿菌為同型發(fā)酵乳酸菌，最適生長溫度為30～35 ℃，其產(chǎn)酸能力強，是制作泡菜、酸奶等食品的主要發(fā)酵劑，用于煙葉發(fā)酵可增加煙葉酸香及柔和煙氣[3]；米曲霉可代謝產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等，常用于發(fā)酵生產(chǎn)醬油和豆豉，用于制備口用型煙草制品可增強其勁頭，讓食用者得到滿足[5]51。

淀粉是煙葉中主要的碳水化合物，可被降解為還原糖，繼而裂解產(chǎn)生酸性物質(zhì)平衡堿性煙氣，協(xié)調(diào)煙葉香氣[6-7]。在一定范圍內(nèi)，煙葉感官質(zhì)量隨淀粉含量的下降而提升[8]。淀粉含量過高會影響煙葉的外觀質(zhì)量及燃燒性，過低會加重?zé)熑~土腥味，因此淀粉含量可作為衡量煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。有研究[9-10]采用單一淀粉酶或混合酶制劑降解煙葉淀粉含量，經(jīng)處理的煙葉在香氣質(zhì)、余味及雜氣方面提升效果明顯。

目前研究所采用微生物大多篩選自煙葉表面或土壤，主要為產(chǎn)香酵母或混合細(xì)菌[11]?，F(xiàn)有發(fā)酵技術(shù)在一定程度上可增加煙葉香氣量及掩蓋雜氣，但僅調(diào)控選育階段微生物生長環(huán)境，忽略了發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)對微生物生長和代謝活動的影響，從而使煙葉發(fā)酵速度較慢、風(fēng)味協(xié)調(diào)性欠缺及刺激性強。試驗擬研究外加碳源、氮源，微生物種類和用量、發(fā)酵時間等發(fā)酵工藝參數(shù)對煙葉淀粉降解的影響，并在此基礎(chǔ)上研究煙葉發(fā)酵后的主要化學(xué)指標(biāo)、香氣物質(zhì)及感官評吸的變化，旨在為深入研究微生物發(fā)酵提升煙葉品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

復(fù)烤后煙葉：重慶C2(2012)、貴州FX2F(2012)、江西B2(2013)、山東C2(2012)、始興X2(2013)、永州X2F(2013)，廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司；

米曲霉、植物乳桿菌、黑曲霉：上海佳民釀造食品有限公司；

葡萄糖漿：廣州雙橋股份有限公司；

大豆蛋白肽：湖北健肽生物科技有限公司；

直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

碘、碘化鉀：分析純，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；

氯化鈉、無水乙醇、高氯酸、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：BPH-9162型，上海一恒集團廣東分公司；

超聲發(fā)生器：KH5200E型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

磨煙機：CYCLOTEC 1093型，福斯分析儀器公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計：L5型，上海儀電分析儀器有限公司；

連續(xù)流動化學(xué)分析儀：AA3型，德國Bran+Luebbe公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：DSQ II型，美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙葉發(fā)酵 參照谷月[5]19的方法并修改，取400 g煙葉，去梗除雜，于(22±2) ℃、相對濕度60%條件下平衡水分48 h。將一定量的微生物與葡萄糖漿、大豆蛋白肽混合，加入無菌水充分溶解制成接種液。將接種液均勻噴灑在煙葉上后置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，40 ℃熱風(fēng)干燥2 h。植物乳桿菌、米曲霉及黑曲霉均為商業(yè)直投式微生物，無需進(jìn)行活化。所有對照樣均為未加微生物樣，其余添加物和處理工藝與試驗樣相同。

1.2.2 單因素試驗

(1) 微生物種類對煙葉淀粉含量的影響：分別稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.80‰的米曲霉、植物乳桿菌和黑曲霉，與5.0‰葡萄糖漿及0.05‰大豆蛋白肽混合，加入30%無菌水充分溶解制成接種液。稱取重慶產(chǎn)區(qū)煙葉400 g，將接種液均勻噴灑在煙葉上，30 ℃發(fā)酵5 d。

(2) 植物乳桿菌接種量對煙葉淀粉含量的影響：分別稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.30‰，0.80‰，1.00‰，1.25‰，1.50‰的植物乳桿菌，與5.0‰葡萄糖漿及0.05‰大豆蛋白肽混合，加入30%無菌水充分溶解制成接種液。稱取重慶產(chǎn)區(qū)煙葉400 g，將接種液均勻噴灑在煙葉上，30 ℃發(fā)酵5 d。

(3) 碳源、氮源添加量對煙葉淀粉含量的影響：稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.80‰植物乳桿菌，與葡萄糖漿及大豆蛋白肽(具體添加量見表1)混合，加入30%無菌水充分溶解制成接種液。稱取重慶產(chǎn)區(qū)煙葉400 g，將接種液均勻噴灑在煙葉上，30 ℃發(fā)酵5 d。

(4) 發(fā)酵時間對煙葉淀粉含量的影響：稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.80‰植物乳桿菌，與5.0‰葡萄糖漿及0.05‰大豆蛋白肽混合，加入30%無菌水充分溶解制成接種液。稱取重慶產(chǎn)區(qū)煙葉400 g，將接種液均勻噴灑在煙葉上，30 ℃分別發(fā)酵2，5，8，11，14 d。

1.2.3 因素交互作用影響試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以植物乳桿菌接種量、碳源、氮源添加量及發(fā)酵時間為考察因素，設(shè)計三因素三水平因素交互作用影響試驗，以煙葉淀粉含量為關(guān)鍵指標(biāo)，優(yōu)化煙葉發(fā)酵工藝。

1.2.4 常規(guī)化學(xué)成分及淀粉含量的測定

(1) 水溶性總糖及還原糖：按YC/T 159—2002執(zhí)行。

表1葡萄糖漿與大豆蛋白肽添加量

Table 1 Addition amount of glucose syrup and soybean protein peptide‰

(2) 總植物堿：按YCT 160—2002執(zhí)行。

(3) 總氮：按YCT 161—2002執(zhí)行。

(4) 淀粉：參照何其芳等[12]的方法。

1.2.5 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定 稱取3.000 g煙末(過40目篩)于10 mL固相微萃取瓶中，將85 μm聚丙烯酸酯纖維頭插入固相微萃取瓶中吸附樣品，吸附溫度100 ℃，吸附時間1 h，于進(jìn)樣口脫附，脫附溫度280 ℃，時間60 s。采用TR-5MS彈性石英毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分離樣品。升溫條件：起始溫度40 ℃，以4 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。氣相色譜條件：載氣為高純氦氣(1.0 mL/min)；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)離子源，離子化能量70 eV；電子倍增器電壓350 V；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量范圍m/z35～350；掃描速度3.00 Scans/s。

1.2.6 感官評價 參照YC/T 415—2011《煙草及煙草制品感官評價方法》采用的盲評方式，從香氣量、香氣質(zhì)、余味、刺激性及雜氣5個方面對煙葉品質(zhì)按一定權(quán)重進(jìn)行評價打分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均平行測試3次，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用Excel 2013軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 微生物種類對煙葉淀粉含量的影響 由圖1可知，與對照樣相比，植物乳桿菌和米曲霉發(fā)酵煙葉淀粉含量顯著下降(P<0.05)，其中植物乳桿菌發(fā)酵煙葉下降幅度最大，為47.1%，其次為米曲霉發(fā)酵煙葉，故在煙葉發(fā)酵過程中，植物乳桿菌降解淀粉效果優(yōu)于米曲霉和黑曲霉。煙葉本身具有的微生物種類多、數(shù)量大，會抑制外加微生物的生長，而植物乳桿菌具有很強的發(fā)酵碳水化合物能力[13]，能快速產(chǎn)生乳酸，抑制其他不耐酸雜菌的活動，減少生存競爭，且更適用于植物發(fā)酵[14-15]。

2.1.2 接種量對煙葉淀粉含量的影響 由圖2可知，與對照樣相比，當(dāng)接種量為0.30‰時，煙葉淀粉含量無顯著變化(P>0.05)，說明接種量過小，淀粉未被植物乳桿菌消耗；當(dāng)接種量達(dá)到0.80‰時，煙葉淀粉含量下降幅度最大，達(dá)46.1%；當(dāng)接種量>0.80‰時，淀粉含量下降幅度減小，為21.8%～39.1%，說明接種量超過一定量時，植物乳桿菌消耗淀粉的能力并不會隨著接種量的增加而增強，反而有所減弱。這可能是由于進(jìn)一步增加接種量使得菌株間生存競爭增加[16]，微生物區(qū)系形成受阻礙，植物乳桿菌生長及代謝活動受抑制，不利于淀粉降解。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effect of microbial species on starch content of tobacco leaves

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effect of inoculation amount on starch content of fermented tobacco leaves

2.1.3 碳源、氮源添加量對煙葉淀粉含量的影響 由圖3可知，未添加碳、氮源時，煙葉淀粉含量較高，主要原因是由于煙葉本身的碳源、氮源不易被植物乳桿菌利用，導(dǎo)致煙葉本身的營養(yǎng)物質(zhì)不能提供足夠的能量，致使植物乳桿菌生長與代謝速度緩慢；當(dāng)碳、氮源添加量分別為0.5‰、0.005‰時，煙葉淀粉含量與對照樣無顯著性差異(P>0.05)，說明外加少量的營養(yǎng)物質(zhì)同樣不足以提供植物乳桿菌生長及代謝活動所需的能量，植物乳桿菌生長與代謝速度仍然較慢；當(dāng)碳、氮源添加量分別為1.0‰、0.010‰時，煙葉淀粉含量顯著降低(P<0.05)，說明外加的碳源和氮源可以提供較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物乳桿菌生長，顯著降低煙葉淀粉含量；當(dāng)碳、氮源添加量分別為5.0‰、0.050‰時，淀粉含量下降幅度最大，達(dá)36.4%，說明補充了足夠的碳、氮源，植物乳桿菌生長與代謝速度迅速提升，煙葉淀粉含量顯著降低；當(dāng)碳、氮源添加量分別>5.0‰、0.050‰時，淀粉含量隨添加量的增加無顯著變化(P>0.05)，是因為碳、氮源添加量過高時，降低了煙葉水分活度，導(dǎo)致植物乳桿菌生長及代謝環(huán)境滲透壓升高[17]，不利于其生長。故碳、氮源的最適添加量分別為5.0‰、0.050‰。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Effect of C and N additions on starch content of fermented tobacco leaves

2.1.4 發(fā)酵時間對煙葉淀粉含量的影響 由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，煙葉淀粉含量逐漸降低，發(fā)酵0～5 d的下降速度最快；當(dāng)發(fā)酵時間為5 d時，煙葉淀粉含量由最初的5.76%下降至3.66%，降幅達(dá)32.8%；當(dāng)發(fā)酵時間為5～11 d時，煙葉淀粉含量變化較小；當(dāng)發(fā)酵時間為11～14 d時，煙葉淀粉含量稍有下降。發(fā)酵前期(0～5 d)，有外加碳源和氮源的作用下，植物乳桿菌生長與代謝速度快，能快速代謝降解煙葉中的淀粉，使煙葉淀粉含量快速降低；發(fā)酵中期(5～11 d)，外加碳源和氮源基本消耗完，同時植物乳桿菌活力也出現(xiàn)了下降，致使煙葉淀粉含量變化較?。话l(fā)酵后期(11～14 d)，外加碳源和氮源全部被消耗完，植物乳桿菌只能利用煙葉中淀粉作為碳源，因而煙葉淀粉含量繼續(xù)下降。同時，發(fā)酵時間對煙葉的外觀、香氣等也有顯著影響，發(fā)酵時間過短，煙葉發(fā)酵不充分，煙葉中淀粉降解不完全，煙葉發(fā)酵所特有的香氣物質(zhì)生成較少[18]；發(fā)酵時間過長會導(dǎo)致煙葉香氣風(fēng)格改變、色澤加深，同時煙葉組織結(jié)構(gòu)被破壞，影響煙葉品質(zhì)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Effect of fermentation time on starch content of fermented tobacco leaves

2.1.5 因素交互作用影響試驗 以煙葉淀粉含量為指標(biāo)，選用重慶煙葉，根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計因素交互作用影響試驗，其因素水平表見表2，試驗結(jié)果與分析見表3。

表2 因素交互作用影響試驗因素水平表

表3 因素交互作用影響試驗結(jié)果與分析

由表3可知，煙葉的最佳發(fā)酵條件為植物乳桿菌接種量0.80‰、碳、氮源添加量分別為5.0‰及0.05‰、發(fā)酵時間8 d，此時淀粉含量最低為3.18%。

2.1.6 揮發(fā)性香氣物質(zhì) 煙葉中所含的大部分揮發(fā)性香氣物質(zhì)與煙葉香氣和雜氣呈顯著正相關(guān)[19]。由表4可知，發(fā)酵前后，煙葉中共檢測到65種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。其中酮類物質(zhì)種類最多，為19種。β-大馬酮具有花香和果香，可以增加煙葉的香氣濃度；茄酮特有的甜香味可以使煙葉香氣醇和細(xì)膩。煙葉發(fā)酵新增乙醛、7-乙基-2-甲基-4-十一酮、異佛爾酮、辛酸、對甲氧基肉桂酸辛酯、2-甲基-1-丁醇等9種物質(zhì)，其中辛酸增加量最大，對煙氣的吸味和口感有積極作用。煙葉中煙堿含量最高，發(fā)酵后煙堿含量下降了5.58%；新植二烯含量僅次于煙堿，是煙葉中重要的中性香氣物質(zhì)，可有效減輕煙葉刺激性，柔和煙氣。

表4 發(fā)酵煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)變化

2.2 最佳工藝發(fā)酵煙葉效果

2.2.1 常規(guī)化學(xué)成分 由表5可知，與對照樣相比，各產(chǎn)區(qū)煙葉淀粉含量顯著降低(P<0.05)，其中重慶煙葉降低最顯著，降低了44.8%，貴州、江西、山東、始興、永州產(chǎn)區(qū)煙葉分別降低了41.5%，44.2%，31.3%，33.1%，25.2%，由于不同煙葉表面微環(huán)境不同，各菌株間生存競爭情況有差異，導(dǎo)致淀粉消耗程度不同[20]；發(fā)酵樣的水溶性總糖、還原糖含量明顯增加，其中重慶產(chǎn)區(qū)煙葉增幅最大，分別為45.6%，37.1%；總植物堿、總氮含量略微減少，植物乳桿菌生長代謝活動降解植物堿使其含量下降，氨基酸、蛋白質(zhì)等含氮化合物分解為氨，氨揮發(fā)使煙葉總氮含量減少；糖堿比明顯提升，氮堿比除始興產(chǎn)區(qū)發(fā)酵樣無明顯變化外，其余產(chǎn)區(qū)發(fā)酵樣稍有提升。水溶性總糖、還原糖及糖堿比的提升可增強煙葉的甜感，協(xié)調(diào)香氣，總植物堿降低可改善煙葉煙氣舒適性及刺激性，總氮含量下降可減輕煙氣異味。

表5 發(fā)酵煙葉的常規(guī)化學(xué)成分

2.2.2 感官評價 由表6可知，各產(chǎn)區(qū)煙葉發(fā)酵后感官評價明顯提升，主要表現(xiàn)為香氣質(zhì)、香氣量的提升及雜氣的減少。重慶、貴州、山東發(fā)酵煙葉感官評價提升效果優(yōu)于始興、江西、永州發(fā)酵煙葉，其中貴州發(fā)酵煙葉提升效果最佳，提升了1.875分，其次為山東發(fā)酵煙葉；貴州發(fā)酵煙葉香氣質(zhì)及香氣量方面提升最明顯，山東發(fā)酵煙葉降低雜氣效果最明顯，各產(chǎn)地發(fā)酵煙葉降低刺激性及增強余味效果差異不顯著。研究[21]表明，不同產(chǎn)區(qū)煙葉香氣前體物質(zhì)對感官評價有影響，煙葉香氣、雜氣等煙氣特性與還原糖呈極顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論

以煙葉淀粉降解為關(guān)鍵指標(biāo)，篩選外加碳、氮源及微生物等，采用單因素結(jié)合因素交互作用影響試驗獲得植物乳桿菌發(fā)酵煙葉的最佳發(fā)酵工藝，并研究了植物乳桿菌發(fā)酵煙葉的化學(xué)成分、香氣物質(zhì)和感官評價。結(jié)果表明，植物乳桿菌、米曲霉和黑曲霉發(fā)酵煙葉均可顯著降低煙葉淀粉含量，其中植物乳桿菌降低煙葉淀粉的能力最強；發(fā)酵煙葉的最佳工藝為植物乳桿菌接種量0.80‰、葡萄糖漿添加量5.0‰、大豆蛋白肽添加量0.05‰、發(fā)酵時間8 d，此時煙葉的淀粉含量顯著下降(P<0.05)，其中重慶發(fā)酵煙葉下降幅度達(dá)44.8%，水溶性總糖、還原糖含量明顯增加；總植物堿、總氮含量略微減少；感官評價顯著提升(P<0.05)，其中貴州發(fā)酵煙葉香氣量、香氣質(zhì)效果提升明顯，山東發(fā)酵煙葉降低雜氣效果明顯。后續(xù)將對發(fā)酵過程中微生物代謝組學(xué)進(jìn)行分析，明晰發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律。

表6發(fā)酵后煙葉較對照煙葉的感官評價提升值?

Table 6 Sensory evaluation of tobacco leaves after fermentation compared with control leaves

煙葉產(chǎn)地香氣質(zhì)香氣量雜氣刺激性余味總分重慶2.01.51.51.51.51.625*貴州2.52.01.51.51.51.875*江西1.51.01.51.01.51.300*山東2.01.52.51.01.01.675*始興0.51.01.01.51.51.025*永州2.01.52.01.01.01.575*

? 總分=香氣質(zhì)×25%+香氣量×25%+雜氣×20%+刺激性×15%+余味×15%；*表示某一產(chǎn)地發(fā)酵樣與對照樣感官質(zhì)量對比差異顯著(P<0.05)。