耿 炤，周青罡，周美娟，于小娟，余日躍

(1.江西匯仁藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330052；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

腎寶糖漿(合劑)是溫補(bǔ)腎陽(yáng)的主要中成藥品種之一，由22味中藥組方經(jīng)提取制劑成型，上市已經(jīng)30余年，目前開(kāi)發(fā)的同方制劑有片劑、顆粒劑、膠囊劑等。腎寶糖漿收載于《中國(guó)藥典》，其溫補(bǔ)腎陽(yáng)，固精益氣，用于腎陽(yáng)虧虛、精氣不足所致的陽(yáng)痿遺精、腰腿酸痛、精神不振、夜尿頻多、畏寒怕冷、月經(jīng)過(guò)多、白帶清稀。研究[1-3]表明，腎寶處方可能存在著淫羊藿苷類黃酮為代表性活性物質(zhì)，作用于泌尿、生殖系統(tǒng)，具有促進(jìn)性功能等方面的作用。為了進(jìn)一步探討腎寶糖漿不同工藝及其主要功效，我們?cè)谝酝芯坎捎谩叭?shì)模型”和“腎損害致陽(yáng)虛模型”基礎(chǔ)上選擇了“重復(fù)應(yīng)激致動(dòng)物性行為低下動(dòng)物模型”結(jié)合交配試驗(yàn)、性激素和性器官指數(shù)，該模型與人的臨床患病機(jī)制接近，且可操作性強(qiáng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD系健康大鼠400只，雌雄各半，平均體質(zhì)量(240±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SYXK(湘)2011-0003。

1.2 供試品與試劑

SJ1、SJ2、SJ3、SJ4、SJ5和白酒，其中SJ1為腎寶糖漿組；SJ2為腎寶糖漿減量組；SJ3為腎寶糖漿浸膏直接加白酒勾兌組；SJ4為腎寶糖漿藥材白酒直接浸泡組；SJ5為腎寶糖漿藥材用白酒超聲提取組，各組均為等劑量溶液，由江西匯仁藥業(yè)有限公司技術(shù)中心提供。

睪酮試劑盒、促卵泡刺激素試劑盒、促黃體生成素試劑盒，由羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供。

1.3 儀器設(shè)備

BL-420/820生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；安全監(jiān)控錄像系統(tǒng)(泰克威視)；水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)；湘雪節(jié)能取暖器(湘雪取暖器廠)；羅氏全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 去勢(shì)雌性大鼠的制備

取雌性大鼠200只，經(jīng)4%水合氯醛腹腔麻醉(1 mL/100 g)后，作腹部正中切口，在無(wú)菌條件下進(jìn)入腹腔，完整摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)后連續(xù)肌肉注射青霉素抗感染3日，5萬(wàn)U/只，每日1次。術(shù)后所有動(dòng)物在同一條件(室溫19～24 ℃，相對(duì)濕度40%左右)用普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

2.2 發(fā)情雌鼠的準(zhǔn)備

雌鼠去勢(shì)2周后用于交配實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前48 h皮下注射20 μg苯甲酸雌二醇，實(shí)驗(yàn)前4 h皮下注射500 μg黃體酮催情，以備交配實(shí)驗(yàn)使用。

2.3 雄性大鼠性能力篩選

將雄性大鼠單獨(dú)置于鼠透明塑料籠具內(nèi)，保持安靜，使用安全監(jiān)控錄像系統(tǒng)進(jìn)行錄像，將光線調(diào)暗至能夠觀察和錄像即可。10 min后將1只發(fā)情雌性大鼠輕放入雄鼠籠內(nèi)，隨即攝下90 min內(nèi)大鼠的交配活動(dòng)。將無(wú)交配記錄的雄性大鼠剔除。

2.4 腎虛雄性大鼠的制備

將具有性能力的168只雄性大鼠隨機(jī)均分為12組，分別為模型組、白酒組、高低劑量SJ1組、高低劑量SJ2組、高低劑量SJ3組、高低劑量SJ4組、高低劑量SJ5組。各組大鼠均采用慢性不可預(yù)知刺激，使大鼠長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，制備應(yīng)激所致大鼠腎虛模型。造模組按以下方法進(jìn)行造模：①冰水游泳：將大鼠放入冷水桶中，15 min/次；②禁水：從早晨8∶00開(kāi)始斷水到次日早晨8∶00，共24 h；③禁食：從早晨8∶00開(kāi)始斷食到次日早晨8∶00，共24 h；④熱應(yīng)激：取暖器調(diào)到約40 ℃恒定，將大鼠放入取暖器中，15 min后取出；⑤明暗顛倒：從早晨8∶00開(kāi)始將大鼠放入自制的暗箱中，晚上8∶00取出，后將大鼠放置在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室中，并通宵照明，至第2天早晨8∶00結(jié)束；⑥夾尾：用大鼠夾尾夾夾在距尾根約1 cm處，每次持續(xù)1 min，一共3次；⑦潮濕墊料：使大鼠置于潮濕環(huán)境中持續(xù)24 h(潮濕墊料按每100 g墊料加水200 mL)；⑧電擊每次5min，一共3次；⑨束縛每次20 min。每日隨機(jī)安排給予1種刺激交替刺激大鼠21天，同一種刺激出現(xiàn)不超過(guò)3次，并且不連續(xù)出現(xiàn)，使其不能預(yù)知給予的刺激。另取12只大鼠作為正常對(duì)照組，不施加任何干擾因素。

表1 大鼠應(yīng)激方法及隨機(jī)排序結(jié)果

2.5 給藥方法

雄性大鼠應(yīng)激21天后開(kāi)始給藥，受試藥物組大鼠每日灌胃給藥1次，分別灌胃高劑量白酒，高(G)低(L)劑量SJ1、高低劑量SJ2、高低劑量SJ3、高低劑量SJ4、高低劑量SJ5、空白組和模型組大鼠每日灌胃給予等容積蒸餾水，灌胃量為6 mL/kg，連續(xù)給藥4周。

2.6 性行為學(xué)觀察

給藥第4周后，同方法3觀察大鼠交配情況，攝下40 min內(nèi)大鼠的交配行為?；胤配浵裼涗浺韵聟?shù)：①騎跨潛伏期：雌雄鼠同籠至雄鼠第1次騎跨所需的時(shí)間；②騎跨總次數(shù)：雌雄鼠同籠后雄鼠出現(xiàn)騎跨行為的總次數(shù)；③騎跨活動(dòng)鼠數(shù)：有騎跨行為的雄性鼠數(shù)；④射精活動(dòng)鼠數(shù)：有射精行為的雄性鼠數(shù)；⑤射精潛伏期；⑥射精間隔期。雄鼠的每一次騎跨并不一定伴有插入。以上參數(shù)用以評(píng)價(jià)大鼠性欲、性喚醒的啟動(dòng)速度、勃起功能的高低。

2.7 動(dòng)物處理

性行為觀察結(jié)束次日，稱取大鼠體質(zhì)量，用3%的異戊巴比妥麻醉大鼠，行腹主動(dòng)脈取血，并立即離心取血清在于-80 ℃冰箱備用；再取出睪丸、附睪、前列腺以及精囊，稱量并記錄，計(jì)算性器官的相應(yīng)指數(shù)。

2.8 性激素的檢測(cè)

取1 mL血清，于全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行睪酮、促卵泡刺激素、黃體生成素的檢測(cè)。

2.9 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)與繪圖軟件為Graphpad Prism 5.0，進(jìn)行方差檢驗(yàn)。所有交配實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均按給藥前后的差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠性行為的影響

所有雄性大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下跨騎潛伏期均有所縮短，但與模型組比較，各給藥組均無(wú)顯著差異性。提示應(yīng)激時(shí)雄性對(duì)雌性大鼠仍有性興趣，SJ對(duì)應(yīng)激大鼠的跨騎潛伏期無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖1。應(yīng)激雄性大鼠跨騎次數(shù)有一定的下降趨勢(shì)，SJ有一定的增加跨騎次數(shù)的趨勢(shì)，但與模型組比較，各組均無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖2。

圖1 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠跨騎潛伏期的影響

圖2 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠跨騎總次數(shù)的影響

雄性大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下，射精潛伏期無(wú)明顯變化，但SJ2～SJ5對(duì)射精潛伏期均有所縮短，與模型組比較，SJ5L組有非常顯著的縮短，提示SJ5L對(duì)提高性行為有一定幫助，見(jiàn)圖3。應(yīng)激可一定程度上延長(zhǎng)雄性大鼠射精的間隔時(shí)間，與模型組比較，SJ2G、SJ3L、SJ3G、SJ4L、SJ5L均有顯著縮短射精間隔時(shí)間的作用，尤其是SJ5L對(duì)縮短射精間隔有非常顯著的作用。提示SJ2～SJ5具有促進(jìn)性功能快速恢復(fù)的能力，且SJ5較SJ2有更顯著的促進(jìn)作用。見(jiàn)圖4。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與白酒組較，^P<0.05，^^P<0.01。

圖3 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠射精潛伏期的影響

圖4 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠射精間隔時(shí)間的影響

3.2 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠性激素的影響

對(duì)FSH、LH的檢測(cè)表明，其血清含量在較低的水平線波動(dòng)，無(wú)顯著的生理學(xué)意義。應(yīng)激對(duì)大鼠睪酮的影響不明顯，SJ對(duì)睪酮含量影響也不明顯，僅SJ1G有顯著提高睪酮含量的作用。見(jiàn)表2、圖5。

組別睪酮(ng/mL)FSH(IU/L)LH(IU/L)對(duì)照組2.18±1.630.05±0.020.04±0.02模型組2.43±2.270.05±0.020.05±0.02白酒藥2.77±1.810.05±0.020.04±0.02SJ1L2.59±1.010.05±0.020.05±0.03SJ1G6.67±3.680.05±0.020.06±0.02SJ2L2.36±1.410.04±0.020.05±0.03SJ2G2.73±2.980.09±0.070.09±0.15SJ3L4.41±2.720.05±0.020.06±0.02SJ3G2.57±1.500.04±0.020.04±0.02SJ4L1.62±1.870.07±0.020.08±0.03SJ4G1.69±1.680.04±0.020.05±0.02SJ5L1.93±1.270.08±0.070.06±0.10SJ5G4.32±3.250.04±0.030.05±0.02

圖5 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠血清睪酮含量的影響

3.3 SJ對(duì)應(yīng)激大鼠性器官指數(shù)的影響

應(yīng)激對(duì)性器官的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，尤其是睪丸與精囊腺抑制性更明顯。與模型組比較，JS2G、SJ3L、SJ4G、SJ5具有對(duì)抗應(yīng)激所致睪丸的生長(zhǎng)抑制作用；白酒組、JS1L、SJ3L、SJ4、SJ5L具有對(duì)抗應(yīng)激所致前列腺抑制作用；JS1L、SJ2L、SJ3L、SJ5具有對(duì)抗應(yīng)激所致精囊腺抑制作用。見(jiàn)表3。

組別睪丸比重前列腺比重精囊比重附睪比重正常組0.69±0.20??0.15±0.060.42±0.10?0.11±0.02模型組0.49±0.070.11±0.030.34±0.080.09±0.01白酒組0.51±0.100.16±0.04??0.38±0.100.10±0.01SJ1G0.50±0.150.12±0.020.40±0.140.08±0.02SJ1L0.55±0.140.17±0.04??0.48±0.05??0.09±0.01SJ2G0.57±0.05?0.14±0.040.42±0.120.08±0.00SJ2L0.56±0.190.14±0.060.42±0.10?0.09±0.01SJ3G0.56±0.140.13±0.050.32±0.130.09±0.02SJ3L0.67±0.11??0.15±0.04?0.50±0.13??0.10±0.02SJ4G0.66±0.17??0.14±0.02?0.40±0.110.09±0.01SJ4L0.52±0.180.13±0.05?0.40±0.140.08±0.02SJ5G0.58±0.10?0.14±0.050.44±0.12?0.09±0.01SJ5L0.60±0.15?0.16±0.05??0.50±0.12??0.10±0.02

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

腎寶最初定位于治療陽(yáng)萎、遺精等疾病，早期研究結(jié)果表明該藥似具有雄性激素樣作用，故對(duì)性機(jī)能減退癥(陽(yáng)萎)有治療功效，能使小鼠的氧耗量稍增，對(duì)能量代謝可能起促進(jìn)作用[4-7]。本研究結(jié)合腎寶的功能主治，明確其動(dòng)物試驗(yàn)上以性功能指標(biāo)和腎陽(yáng)虛指標(biāo)為核心，其中性功能指標(biāo)即動(dòng)物的交配能力、性激素水平、性器官指數(shù)、陰莖海綿體cGMP和陰莖勃起潛伏期等；腎陽(yáng)虛指標(biāo)主要是抗疲勞、自由基水平及部分性功能指標(biāo)。采用應(yīng)激模型較以往的模型更接近臨床，應(yīng)激可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性器官的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，但對(duì)性功能的抑制作用不顯著。

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了腎寶處方采用不同提取工藝制成的不同極性提取物對(duì)性功能的影響，同時(shí)還設(shè)計(jì)了空白對(duì)照和高低劑量組，發(fā)現(xiàn)所有提取物均能顯著縮短雄性大鼠射精間隔，但不同實(shí)驗(yàn)組間具有一定差異。相關(guān)結(jié)合化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的同步研究還在進(jìn)行。本研究為腎寶的處方及其制劑的二次開(kāi)發(fā)提供了一定依據(jù)。