陳偉 劉紅波 肖小紅 吳瑩

結(jié)核分枝桿菌作為與人類共同進(jìn)化最為成功的病原體之一，感染了世界1/4 的人口。2017年，世界新發(fā)結(jié)核病900 萬(wàn)例，130 萬(wàn)例死亡（包括30萬(wàn)艾滋病毒感染者），而我國(guó)新發(fā)結(jié)核病例占世界的9%，耐藥結(jié)核占世界的13%[1～3]，目前結(jié)核病的疫情和防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的，以氣溶膠形式通過(guò)呼吸道在人與人之間傳播。結(jié)核分枝桿菌在環(huán)境中分布廣泛，不產(chǎn)生毒素，具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，含豐富的脂質(zhì)，對(duì)外界環(huán)境和藥物有很強(qiáng)的抵御能力。本研究擬通過(guò)收集在我院傳染科住院治療的結(jié)核病患者資料和痰液標(biāo)本，了解本地區(qū)結(jié)核病的主要流行菌株和耐藥情況，為本地區(qū)的結(jié)核病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月～2019年10月在我院傳染科住院治療的痰涂陽(yáng)性結(jié)核病患者217例，收集患者基本資料（性別、年齡、病史等），并于清晨采集痰液進(jìn)行分離培養(yǎng)：痰液中加入4%氫氧化鈉充分溶解，并均勻接種于酸性羅氏培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)3～4 周。

1.2 主要試劑與儀器異煙肼（H）、利福平（R）、鏈霉素（S）、乙胺丁醇（E）、7H9 液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；分枝桿菌酸性羅氏培養(yǎng)基及藥敏實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自行制備；Tap DNA 聚合酶、dNTP、引物購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；TGradinent PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司；電泳儀及凝膠電泳成像系統(tǒng)購(gòu)自北京君正醫(yī)療設(shè)備有限公司。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為參照菌株（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供）。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn)采用比例法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，取分離培養(yǎng)2～3周的新鮮菌落，加入含0.5%吐溫-80 的生理鹽水中，充分混勻，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁埽∕acFarland No.1）比濁，配成1mg/ml 的菌液濃度。用22 SWG 的標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)配成2～10mg/ml 菌液，均勻接種于含異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇的培養(yǎng)基表面，置于37℃培養(yǎng)箱中，4 周后觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)核分枝桿菌總DNA提取采用熱裂解法提取總DNA，從分離培養(yǎng)基上刮取適量菌體溶于蒸餾水，漩渦振蕩器上振蕩使菌落溶解均勻。于80℃滅活30min，8 000r/min 離心。棄上清后加400μl TE混勻，100℃ 30min，離心后取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 “北京家族”菌株的鑒定采用RD105 缺失基因檢測(cè)法鑒定“北京家族”菌株，上游引物F：5'-CG TGCACAGTTGCGTGTGTA-3'；下游引物R：5'-CGT CGTATTCTGCCGATACT-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為266bp。PCR反應(yīng)體系：Tap DNA 聚合酶0.5μl，dNTP 2.0μl（2.5mmol/L），引物各0.5μl，模板DNA 2.0μl，Buffer 2.5μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，70℃ 45s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性說(shuō)明存在RD105 基因，缺失則為“北京家族”菌株。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RD105缺失基因檢測(cè)法鑒定結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為266bp，1號(hào)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，2～5號(hào)為“北京家族”菌株，6號(hào)為非“北京家族”菌株，見(jiàn)圖1。

圖1 RD105 缺失基因檢測(cè)法鑒定“北京家族”菌株

2.2 痰涂陽(yáng)性住院患者基本資料本地區(qū)住院治療的結(jié)核病患病人群以老年男性（＞60歲）為主，男性患病率明顯高于女性，為女性的2.24倍。本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌流行菌株為“北京家族”基因型（66.8%），“北京家族”基因型流行趨勢(shì)在年齡、性別、初治和復(fù)治患者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 住院治療的結(jié)核病患者基本情況[n（%）]

2.3 臨床分離株耐藥情況217例臨床分離株中總耐藥率為37.8%，其中耐鏈霉素（S）24.9%、耐異煙肼（H）23.5%、耐利福平（R）16.6%、耐乙胺丁醇（E）9.2%、耐多藥（Multi-drug resistant，MDR）10.6%，耐藥和耐多藥在“北京家族”和非“北京家族”之間比較無(wú)差異，復(fù)治患者耐單藥和耐多藥率明顯高于初治患者（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 217例臨床分離株耐藥情況

3 討論

隨著抗結(jié)核藥物的大量使用，結(jié)核分枝桿菌在不斷的進(jìn)化以適應(yīng)新的宿主環(huán)境，由于治療不規(guī)范、不徹底導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，同時(shí)單耐藥菌株向多耐藥、耐多藥和廣泛耐藥轉(zhuǎn)變。這些耐藥菌株的出現(xiàn)給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，同時(shí)也增加了防控難度，因此了解本地區(qū)結(jié)核病的流行情況及耐藥情況對(duì)本地區(qū)的結(jié)核防治具有重要意義?！氨本┘易濉本晔鞘澜绶秶鷥?nèi)廣泛流行的結(jié)核分枝桿菌分型，約占全部菌株的1/3，具有傳播能力強(qiáng)、毒力高等特點(diǎn)[4，5]。在我國(guó)，大部分地區(qū)的報(bào)道感染率超過(guò)50%，尤其在北方地區(qū)高達(dá)90%以上。本研究顯示：湘中地區(qū)“北京家族”菌株占全部臨床分離株的66.8%，處于全國(guó)平均水平?！氨本┘易濉本昱c耐藥的相關(guān)性一直是結(jié)核病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但研究結(jié)果并不一致，有研究認(rèn)為“北京家族”與異煙肼、利福平以及MDR 耐藥有關(guān)[6～8]，另外的研究發(fā)現(xiàn)非“北京家族”與鏈霉素耐藥相關(guān)[9，10]，也有觀點(diǎn)認(rèn)為“北京家族”菌株與耐藥無(wú)關(guān)[11]。本研究未發(fā)現(xiàn)“北京家族”與耐藥有相關(guān)性，可能與樣本量過(guò)少、藥物敏感性檢測(cè)的主觀因素影響過(guò)大有關(guān)，下一步研究可以從基因耐藥和“北京家族”菌株的相關(guān)性入手進(jìn)行探討。另外“北京家族”菌株與患者性別、年齡及治療史均無(wú)明顯相關(guān)性。

世界衛(wèi)生組織報(bào)道2017年全世界新發(fā)結(jié)核病例男性為580 萬(wàn)，女性為320 萬(wàn)，男性和女性在結(jié)核病患病率上有明顯差異，男性約為女性的1.81倍，其中俄羅斯達(dá)到4.93倍，大部分地區(qū)為0.8～1.13倍[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在本地區(qū)結(jié)核病患者中男性為女性的2.24倍，高于世界平均水平。目前認(rèn)為吸煙和飲酒可能是男性結(jié)核病患病率高的原因之一，WHO 報(bào)告顯示20%的結(jié)核病患者有吸煙史，多項(xiàng)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)吸煙者的患病風(fēng)險(xiǎn)是非吸煙者的2.28～2.74倍[13～16]。有關(guān)飲酒與結(jié)核病的研究表明，在調(diào)整教育和吸煙的影響因素后，飲酒者的患病風(fēng)險(xiǎn)是非飲酒者的1.5倍[17]。最新的研究發(fā)現(xiàn)女性的中性粒細(xì)胞中平均表達(dá)水平較高的基因（n=682）與免疫反應(yīng)和相關(guān)通路有關(guān)，而男性平均表達(dá)增加的基因（n=2 675）主要涉及細(xì)胞基本的生命過(guò)程，如RNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯[18，19]。女性通常表現(xiàn)出比男性更強(qiáng)的免疫力，這也可能是女性結(jié)核病患者數(shù)低于男性的重要原因之一。

藥敏結(jié)果顯示，本地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)一線抗結(jié)核藥物的總耐藥率為37.8%，其中耐鏈霉素（S）24.9%、耐異煙肼（H）23.5%、耐利福平（R）16.6%、耐乙胺丁醇（E）9.2%、耐多藥10.6%，本地區(qū)總耐藥率處于湖南省結(jié)核耐藥平均水平，略高于全國(guó)耐藥水平[20，21]。復(fù)治患者的總耐藥率、單一耐藥率、MDR 耐藥率明顯高于初治患者。直接督導(dǎo)短程化療（Directly observed treatment for short course，DOTS）是世界衛(wèi)生組織推薦的結(jié)核病控制策略，能夠有效解決不合理、不規(guī)律用藥問(wèn)題，有效減少耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生。臨床醫(yī)生應(yīng)嚴(yán)格按照DOTS 原則，管理和督促結(jié)核病患者，避免耐藥性的產(chǎn)生，有效降低復(fù)治患者的耐藥率。