孟衛(wèi)榮，李珍珍，韓軍濤

空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院燒傷與皮膚外科(西安 710032)

巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞，是釋放炎癥介質(zhì)的固有免疫主力軍，因此在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起到了核心作用[1-2]。在膿毒癥初期，該細胞被激活，釋放大量炎癥相關(guān)因子，從而引發(fā)炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，最終導致全身性炎癥反應(yīng)[2-5]，因此，巨噬細胞的異?；罨跈C體失控性炎癥反應(yīng)，以及引發(fā)的多臟器功能衰竭甚至膿毒癥等病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由此，控制巨噬細胞炎癥反應(yīng)尤為重要。核受體(Nuclear receptors，NRs)是配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，在機體中主要起調(diào)節(jié)代謝、發(fā)育和免疫等作用[6-7]。其中“視黃酸相關(guān)孤核受體”(Retinoid-related orphan receptors，RORs)屬于NR超家族，有研究表明，RORs亞家族RORα在免疫細胞尤其是巨噬細胞中高表達[6,8]。RORα敲除小鼠中，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘發(fā)的炎癥介質(zhì)釋放水平明顯高于野生鼠，同時，敲除鼠中腹腔內(nèi)巨噬細胞在LPS刺激下，其炎癥因子的表達量是野生小鼠巨噬細胞的5～10倍[9-10]。由此看來，RORα對機體免疫系統(tǒng)以及巨噬細胞炎癥反應(yīng)具有潛在的調(diào)控作用。然而，RORα在LPS誘發(fā)巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的表達變化，以及對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用尚不明確。本研究通過分離小鼠骨髓來源的巨噬細胞(Bone marrow derived macrophages，BMDMs)，觀察LPS在不同時間點刺激巨噬細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)條件下，RORα的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平變化，以及RORα激動劑和抑制劑分別預(yù)處理后，對LPS誘發(fā)炎癥因子釋放的影響，初步驗證RORα對脂多糖所致小鼠巨噬細胞炎癥反應(yīng)具有緩解作用。

材料與方法

1 材 料

1.1 動物：實驗動物選取健康的6～8周雄性C57BL/C6小鼠，體重(25±5)g，飼養(yǎng)條件為晝夜節(jié)律12 h/12 h，自由飲水攝食。所有實驗動物均由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗中動物操作及處理均符合空軍軍醫(yī)大學動物倫理委員會定制的原則及操作規(guī)范。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組：小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)取自6～8周雄性C57BL/C6小鼠，小鼠頸椎脫臼處死后，取雙側(cè)股骨與脛骨，移至超凈工作臺，使用1 ml注射器沖洗骨髓并收集，1000 r/min離心5 min，使用含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸后，在37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，去除貼壁較快的雜細胞，收集未貼壁細胞鋪于細胞培養(yǎng)皿中，加入20 ng/ml巨噬細胞集落刺激因子，培養(yǎng)5 d后，對細胞進行分組處理。熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測100 ng/ml LPS處理不同時間點：0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h的白細胞介素-1β(Interleukin1β,IL-1β)和RORα轉(zhuǎn)錄水平的變化。不同處理組血清中炎癥因子的含量：①正常組：1∶1000 DMSO；②LPS組：100 ng/ml LPS；③5 μmol/L SR1078+100 ng/ml LPS；④10 μmol/L SR3335+100 ng/ml LPS。SR1078/SR3335作用24 h后，加入LPS處理2 h后取樣觀察，每種條件重復(fù)5次，本試驗至少可以獲得3次可重復(fù)結(jié)果。

1.3 主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；巨噬細胞集落刺激因子購自美國PeproTech公司；LPS購自美國Sigma公司；SR1078和SR3335購自美國MCE公司；Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司；RORα和GAPDH一抗購自中國Proteintech公司；ELISA試劑盒購自中國欣博盛生物公司。

2 實驗方法

2.1 qRT-PCR法檢測細胞中蛋白轉(zhuǎn)錄水平：BMDMs分別加入100 ng/ml LPS處理不同時間點：0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h后，使用Trizol裂解法提取RNA，步驟嚴格按照Invitrogen公司的實驗步驟進行，每組進行5個重復(fù)。得到的RNA用分光光度計讀取OD260/OD280比值及RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用TB Green試劑盒進行熒光定量PCR，分別以小鼠IL-1β，腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和RORα為引物，IL-1β上游引物 5’-CAACCAACAAGTGATATTCT

CCATG-3’，下游引物5’-GATCCACACTCTCCAGC

TGCA-3’， TNF-α上游引物5’-TATGGCCCAGACCCTCACA-3’，下游引物5’-GGAGTAGACAAGGTACAACCCATC-3’， RORα上游引物5’-TCAGCAGAGCAATGCCACCTAC-3’，下游引物5’-TGGACATCCGACCAAACTTGAC-3’；以小鼠GAPDH作為內(nèi)參，上游引物5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物5’-TTGCTGTTGAAGTC

GCAGGAG-3’，反應(yīng)體系為20 μl，利用2ΔΔCT法計算分析。

2.2 免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中RORα蛋白水平：BMDMs分別加入100 ng/ml LPS處理不同時間點：0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h后，加入RIPA細胞裂解液收集細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度后，加入上樣緩沖液Loading buffer，100 ℃處理5 min。取20 μg蛋白樣品加樣到10% SDS-PAGE膠中，電泳約2 h后，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜60 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，孵育相應(yīng)一抗4 ℃過夜，RORα一抗(1∶1000)和GAPDH一抗(1∶2000)。二抗(1∶4000)室溫孵育2 h后，ECL 方法顯影成像，并用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

2.3 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL-1β，TNF-α和白介素6(Interleukin-6，IL-6)的含量：各組細胞SR1078/SR3335作用24 h后，加入LPS處理2 h后取出細胞上清液，1000 r/min離心5 min后收集上清。步驟嚴格按照欣博盛生物公司的ELISA試劑盒說明進行，每個樣做5個復(fù)孔，按照步驟加入各種反應(yīng)試劑，根據(jù)樣品在波長450 nm的酶標儀中讀取OD值，與同時制作的標準曲線進行對比，計算細胞上清液中炎癥因子的濃度。

結(jié) 果

1 BMDMs在LPS處理不同時間點蛋白轉(zhuǎn)錄水平的表達 BMDMs在LPS處理0 h、1 h、2 h、 6 h、12 h和24 h后，對其進行炎癥因子IL-1β和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的檢測，結(jié)果顯示，LPS處理后，IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)了顯著升高(P<0.01 vs 0 h)，且在2 h左右出現(xiàn)了峰值，與0 h相比，IL-1β值為(204.98±42.04)，TNF-α值為(23.77±3.37)，提示LPS處理致使BMDMs釋放炎癥因子，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。同時檢測RORα轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與處理0 h相比，RORα表達水平在1-12 h均出現(xiàn)了明顯降低(P<0.01)，且在2 h左右最為顯著，說明在BMDMs炎癥反應(yīng)過程中，RORα表達受到抑制，且與炎癥因子IL-1β和TNF-α表達成負相關(guān)，初步提示RORα可能參與了巨噬細胞炎癥反應(yīng)過程，見表1。

表1 BMDMs在LPS處理不同時間點蛋白轉(zhuǎn)錄水平的表達

注：與0 h相比,*P<0.01

2 BMDMs在LPS處理不同時間點RORα蛋白水平的表達 為了進一步驗證RORα在BMDMs炎癥反應(yīng)中的表達變化，我們通過Western blot法檢測其蛋白水平，結(jié)果顯示，與LPS處理0 h相比，RORα蛋白表達水平在處理1 h、2 h、6 h和24 h均出現(xiàn)了顯著的降低(P<0.05，P<0.01)，且與轉(zhuǎn)錄水平變化相似，進一步提示RORα在LPS刺激下表達水平受到顯著抑制(圖1)。

注：與0 h相比，*P<0.05，#P<0.01

3 RORα對LPS所致巨噬細胞炎癥因子釋放的影響 對BMDMs進行預(yù)處理，一組加入RORα激動劑5 μmol/L SR1078，一組加入RORα拮抗劑10 μmol/L SR3335，處理24 h后，加入LPS處理，2 h后，利用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL-1β，TNF-α和IL-6的含量，結(jié)果顯示，LPS組中，IL-1β，TNF-α和IL-6的含量均出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.01)，而在SR1078預(yù)處理組中，與LPS組相比，IL-1β，TNF-α和IL-6含量均出現(xiàn)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，同時，SR3335與處理組中，得到了相反結(jié)果，即與LPS組相比，IL-1β，TNF-α和IL-6含量均明顯升高(P<0.05)。以上結(jié)果提示，RORα能夠顯著抑制LPS所致的巨噬細胞炎癥因子的釋放。見表2。

表2 BMDMs細胞炎癥因子含量的表達(pg/ml)

注：與正常組相比,*P<0.01；與LPS組相比,#P<0.05，△P<0.01

討 論

巨噬細胞作為重要的固有免疫細胞，是機體在血液和組織器官循環(huán)中抵御疾病的第一道防線，當機體受到外界病菌侵入時，巨噬細胞通過吞噬和降解作用清除抗原和細菌的同時，釋放IL-1β和TNF-α等炎性介質(zhì)導致炎癥反應(yīng)[1,11-12]，在炎癥反應(yīng)過程中，巨噬細胞既是啟動細胞，也是效應(yīng)細胞，炎癥因子的釋放可進一步激活巨噬細胞，導致炎癥的級聯(lián)瀑布效應(yīng)，從而導致全身的炎癥反應(yīng)綜合征，最終引發(fā)膿毒癥休克、多臟器損傷等癥狀[4,13-14]，因此，巨噬細胞的異?；罨谘装Y反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。臨床上由細菌感染引發(fā)的膿毒癥占到了95%以上，而細菌感染引起的內(nèi)毒素LPS的釋放是導致膿毒癥的主要因素[5,15-16]，因此，本研究采用LPS刺激BMDMs，觀察對其炎癥因子表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS在1～24 h不同時間點處理下，炎癥因子IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)了顯著的升高，提示LPS可誘發(fā)巨噬細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。

RORα在各個組織中廣泛表達，且在免疫系統(tǒng)，尤其是巨噬細胞中高表達[9,17]。研究表明，RORα在巨噬細胞中的表達受到嚴格控制，在靜息狀態(tài)下，RORα高表達，而Toll樣受體被激活時，其表達水平顯著受到抑制[9-10]，提示RORα可能具有控制巨噬細胞炎癥反應(yīng)的作用。本研究在LPS激活BMDMs發(fā)生炎癥反應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)RORα轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均受到顯著下調(diào)，尤其在1～6 h，且2 h時最為顯著，與炎癥因子的表達水平呈負相關(guān)，這與前期研究結(jié)果相符，提示RORα可能參與了炎癥因子的釋放。在RORα基因敲除鼠中，LPS誘發(fā)的炎癥因子的釋放水平明顯高于野生鼠，同時，敲除鼠中腹腔內(nèi)巨噬細胞在LPS刺激下，其炎癥因子的表達量是野生小鼠巨噬細胞的5～10倍[17- 18]。提示RORα對巨噬細胞炎癥反應(yīng)具有潛在的調(diào)控作用。本研究通過采用RORα激動劑SR1078和拮抗劑SR3335預(yù)處理巨噬細胞，使其在細胞中高表達或抑制表達，進而觀察LPS刺激下，巨噬細胞的炎癥介質(zhì)釋放情況，發(fā)現(xiàn)在SR1078預(yù)處理的細胞中，LPS刺激下，其炎癥因子的釋放受到了顯著的抑制作用，而拮抗劑SR3335的作用正好相反，進一步活化了巨噬細胞炎癥因子的釋放，該結(jié)果說明RORα能夠顯著抑制LPS誘發(fā)的巨噬細胞炎癥因子的釋放，進而緩解炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過LPS激活BMDMs釋放炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)的同時，RORα轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均受到顯著的抑制作用，而當誘導RORα表達上調(diào)或者下調(diào)后，LPS對巨噬細胞炎癥介質(zhì)的釋放具有顯著的抑制或促進作用，提示RORα在巨噬細胞調(diào)控炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，這為減輕失控性炎癥反應(yīng)提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點。