才 昊，韓 亮，李曉飛

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胸外科(錦州 121000)

肺癌是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)腫瘤，也是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占腫瘤死因第一位，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是其常見(jiàn)病理類型，占全部肺癌的80%[1]。目前，肺癌發(fā)病因尚未完全明確，認(rèn)為與吸煙、環(huán)境污染、肺部慢性感染及遺傳等因素有關(guān)。然其發(fā)病隱匿，早期臨床特征及表現(xiàn)不典型，致其早期確診率低下，大多患者就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，整體預(yù)后不佳。因此對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究與探討，對(duì)肺癌的臨床治療及改善患者預(yù)后具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸序列且不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA，其在多種細(xì)胞水平均可通過(guò)復(fù)雜分子機(jī)制進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控[2]，但其機(jī)制特點(diǎn)尚不明確。最新研究[3]表明，LncRNA作為調(diào)節(jié)因子幾乎參與全部細(xì)胞過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促癌或抑癌作用。并有研究[4]表明，LncRNA可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲，可作為評(píng)判腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及預(yù)后的預(yù)測(cè)標(biāo)志。LncRNA XIST是XIST基因產(chǎn)物，位于人染色體Xq13.2，參與調(diào)控X染色體失活[5]。研究[6-7]證實(shí)XIST是具有生物學(xué)功能的LncRNA，在乳腺癌、卵巢癌、人鼻咽癌等腫瘤中均高表達(dá)。且最近研究指出，XIST與NSCLC患者預(yù)后密切相關(guān)[8]。然有關(guān)XIST在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未闡明且未見(jiàn)太多研究報(bào)道。因此，本研究就LncRNA XIST調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，以期為臨床治療提供新的方向和思路。

材料與方法

1 材料及儀器 本研究所用非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、Calu-3及人支氣管上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。試劑及儀器：RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；MTT試劑、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；XIST siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)公司合成；RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；PCNA、CCND1、Bcl-2、MMP-9抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；miR-186-5p模擬/抑制物、XIST表達(dá)載體均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；熒光定量PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司等。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 研究所用NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、Calu-3培養(yǎng)于DEME培養(yǎng)基，人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B培養(yǎng)于PRMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)取出培養(yǎng)皿，加入含0.03%濃度EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)3次后行細(xì)胞凍存處理。

3 LncRNA XIST與miR生物信息學(xué)分析 通過(guò)檢索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和DIANA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與LncRNA XIST結(jié)合的miRNA，取兩者檢測(cè)交集同時(shí)結(jié)合NSCLC現(xiàn)有miRNA研究信息，篩選出與XIST存在結(jié)合位點(diǎn)的 miR-186-5p。

4 引物設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和Primer5.引物設(shè)計(jì)軟件以GAPDH及U6為內(nèi)參進(jìn)行LncRNA XIST、XIST干擾序列siRNA和miR-186-5p引物的檢測(cè)設(shè)計(jì)，并構(gòu)建包含miR-186-5p識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的野生型(pmir GLO-XIST-Wt)和突變型(pmir GLO-XIST-Mut)XIST片段熒光酶素報(bào)告基因載體。引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

5 XIST siRNA轉(zhuǎn)染 于12孔培養(yǎng)皿中接種適量NSCLC細(xì)胞，1 ml DNEM+10%FBS培養(yǎng)待細(xì)胞匯合率達(dá)到30%～50%，1.5 ml無(wú)菌EP管加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，后分別加入終濃度為100 nmol/L的XIST siRNA和5 μl Lipofectamine 2000，混勻靜置20 min，再加入RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物正常培養(yǎng)6～8 h后換為新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。RT-PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率。

6 miR-186-5p mimic及inhibitor轉(zhuǎn)染 構(gòu)建miR-186-5p mimic及inhibitor表達(dá)載體，同上接種、培養(yǎng)細(xì)胞至30%～50%匯合率，無(wú)菌EP管加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，分別加入終濃度為100 nmol/L的miR-186-5p mimic或inhibitor和5μl Lipofectamine 2000，混勻靜置20 min再加入RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，后續(xù)培養(yǎng)方式同上。

7 RT-PCR 采用Trizol法并參照其反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各細(xì)胞總RNA，利用紫色分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280吸收值及RNA純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)及其反應(yīng)體系分別加入總RNA及LncRNA XIST或miR-186-5p的逆轉(zhuǎn)錄RT引物，逆轉(zhuǎn)錄獲取其cDNA；后根據(jù)熒光定量反應(yīng)試劑盒及其反應(yīng)體系將所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：LncRNA XIST：95 ℃(60 s)、95 ℃(15 s)、60 ℃(60 s)、72 ℃(30 s)，循環(huán)40次；miR-186-5p：94 ℃(10 min)、94 ℃(15 s)、69 ℃(60 s)、72 ℃(30 s)，循環(huán)40次，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用2-△△Ct法定量分析各細(xì)胞系中LncRNAXIST或miR-186-5p相對(duì)表達(dá)量。選取轉(zhuǎn)染效率較明顯的兩組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

8 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性 待NSCLC細(xì)胞系成功轉(zhuǎn)染XIST siRNA 48 h后分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，2×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)8個(gè)平行孔。于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后24 h、48 h、72 h取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除上清液，加入150 μl二甲基亞砜振蕩溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各細(xì)胞光密度值。

9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 -20 ℃冰箱中取出Matrigel基質(zhì)膠室溫過(guò)夜液化稀釋為工作液，加入Transwell小室底部膜上室，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min膠化Matrigel；無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h后制成細(xì)胞懸液，于Transwell培養(yǎng)板上室加入100 μl細(xì)胞懸液和200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入600 μl RPMI 1640培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)24 h；取出小室，95%酒精固定，結(jié)晶紫溶液染色；隨機(jī)選取三個(gè)視野于高倍鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，取其平均值。

10 Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)蛋白含量 收集成功轉(zhuǎn)染XIST siRNA后的NSCLC細(xì)胞系，利用RIPA裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，后采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定提取蛋白濃度；采用轉(zhuǎn)印蛋白及免疫檢測(cè)于電泳結(jié)束前進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理，后將PVDF膜放入BSA 室溫封閉 2 h，TBST 洗膜 3次，加入TBST稀釋的PCNA孵育過(guò)夜；利用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗室溫孵育 2 h；膜于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)2 min，取膜，包好PVDF膜，于暗室中行X 膠片感光、顯影、定影。

11 熒光酶素報(bào)告實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前一天按2×104個(gè)/孔濃度接種于 24 孔板，含10% FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度至50%～60%時(shí)加入300 μl OPTI-MEM 培養(yǎng)基及用其稀釋的1 μl Lipofectamine 2000，終體積50 μl，靜止5 min，加入20 μmol/L的miRNA 1 μl和熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒0.1 μg及轉(zhuǎn)染復(fù)合物液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育轉(zhuǎn)染48 h， PLB裂解收集裂解液至發(fā)光板，加入LAR Ⅱ 工作液及Stop & Glo Reagent，混勻，分別讀值2 s，保存數(shù)據(jù)。

12 RIP實(shí)驗(yàn) 預(yù)冷PBS液清洗NSCLC細(xì)胞系2次，加入RIP Lysis Buffer置于冰上裂解并收集產(chǎn)物-80 ℃保存；后制備重懸磁珠，加入5 μl AgO2/IgG 抗體孵育去上清，RIP Wash Buffe 清洗 2 次；每管磁珠AgO2/IgG 抗體混合物中加入RIP Immunoprecipitation Buffer，裂解、離心，取上清至磁珠-抗體管中行RNA 結(jié)合蛋白-RNA 復(fù)合物免疫沉淀及RNA純化。

13 營(yíng)救實(shí)驗(yàn) 分別構(gòu)建miR-control、miR-186-5p mimics、XIST表達(dá)載體及miR-186-5p mimics + XIST表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞系，分別設(shè)為control組、miR-186-5p組、XIST組及miR-186-5p + XIST組；接種于12孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率達(dá)50%，1.5 ml離心管加入100 mmol/L miR-186-5p、100 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基和(或)2 μg 表達(dá)載體質(zhì)粒及4 μl Lipofectamine 2000混勻，加入脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)。待轉(zhuǎn)染48 h后分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成懸液，分別進(jìn)行MTT、Transwell實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

結(jié) 果

1 NSCLC細(xì)胞系中LncRNA XIST表達(dá)情況 采用RT-PCR法以BEAS-2B細(xì)胞系為對(duì)照，對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、Calu-3中LncRNA XIST表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：NSCLC細(xì)胞系中LncRNA XIST表達(dá)水平均顯著高于人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B(P<0.05,圖1)。

圖1 NSCLC細(xì)胞系中LncRNA XIST表達(dá)水平

2 轉(zhuǎn)染XIST siRNA后NSCLC細(xì)胞中XIST和miR-186-5p表達(dá)情況 選取表達(dá)相對(duì)較高的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299轉(zhuǎn)染XIST siRNA敲降其LncRNA XIST表達(dá)，以si-NC組作為陰性對(duì)照。RT-PCR檢測(cè)顯示：與si-NC組相比，敲降XIST后A549、H1299細(xì)胞中LncRNA XIST表達(dá)顯著降低，miR-186-5p表達(dá)顯著增高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

注：兩組比較，*P<0.05

3 轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic及inhibitor后NSCLC細(xì)胞系中XIST表達(dá)情況 分別轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic及 inhibitor至A549、H1299細(xì)胞系，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549、H1299細(xì)胞中XIST表達(dá)情況，以空白Control組作為對(duì)照。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic后A549、H1299細(xì)胞中XIST表達(dá)顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-186-5p inhibitor后A549、H1299細(xì)胞中XIST表達(dá)顯著升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示過(guò)表達(dá)miR-186-5p可顯著降低NSCLC細(xì)胞中XIST表達(dá)(圖3)。

4 敲降XIST抑制NSCLC細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染敲降A(chǔ)549、H1299細(xì)胞中XIST表達(dá)，以si-NC組作為陰性對(duì)照。采用MTT法分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h,利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各組細(xì)胞光密度值。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48 h、72 h 時(shí)，A549、H1299細(xì)胞的si-XIST組OD值顯著低于si-NC組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示敲降XIST抑制NSCLC細(xì)胞增殖能力(圖4)。

注：三組比較，*P<0.05

5 敲降XIST抑制NSCLC細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染敲降A(chǔ)549、H1299細(xì)胞中XIST表達(dá)，以si-NC組作為陰性對(duì)照。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549、H1299細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果顯示：敲降XIST表達(dá)后，A549、H1299細(xì)胞平均每視野穿過(guò)細(xì)胞數(shù)較si-NC組明顯減少，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示敲降XIST抑制NSCLC細(xì)胞侵襲能力(圖5)。

注：兩組比較，*P<0.05

6 敲降XIST抑制NSCLC細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染敲降XIST對(duì)A549、H1299細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白CCND1、PCNA、MMP-9及Bcl-2表達(dá)的影響，以內(nèi)參蛋白β-actin為對(duì)照。結(jié)果顯示：敲降XIST表達(dá)后，A549、H1299細(xì)胞中CCND1、PCNA、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)水平較內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)降低(圖6)。

圖6 敲降XIST后CCND1、PCNA、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)降低

7 XIST與miR-186-5p結(jié)合驗(yàn)證 通過(guò)檢索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和DIANA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出與LncRNA XIST存在結(jié)合位點(diǎn)的miR-186-5p,并構(gòu)建包含miR-186-5p識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的pmir GLO-XIST-Wt和pmir GLO-XIST-Mut熒光酶素報(bào)告基因載體。為進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的調(diào)控關(guān)系，研究以miR-NC為對(duì)照，將miR-186-5p mimic分別轉(zhuǎn)染至NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299中，并同時(shí)轉(zhuǎn)染pmir GLO-XIST-Wt和pmir GLO-XIST-Mut報(bào)告質(zhì)粒載體。采用熒光酶素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光霉素活性，結(jié)果顯示：共轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic和pmir GLO-XIST-Wt可使A549、H1299細(xì)胞熒光酶素活性降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic和pmir GLO-XIST-Mut則不能引起報(bào)告載體熒光素酶活性改變，提示XIST是miR-186-5p的靶向基因(圖7)。

注：兩組比較，*P<0.05

8 miR-186-5p調(diào)控 XIST 采用RIP實(shí)驗(yàn)(RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn))檢測(cè)XIST和miR-186-5p是否存在于相同RISC復(fù)合體，沉淀在A549、H1299細(xì)胞中包含miRNA及與其結(jié)合的LcnRNA的內(nèi)源性Ago2蛋白。RT-PCR檢測(cè)Ago2蛋白和IgG蛋白中XIST和miR-186-5p表達(dá)水平，結(jié)果顯示：A549、H1299細(xì)胞中XIST和miR-186-5p在Ago2免疫沉淀復(fù)合物中的表達(dá)含量顯著高于IgG免疫沉淀復(fù)合物(P<0.05)，提示miR-186-5p以Ago2依賴的方式調(diào)控XIST(圖8)。

注：三組比較，*P<0.05

9 miR-186-5p抑制XIST促進(jìn)細(xì)胞的增殖作用選取A549細(xì)胞為例分別轉(zhuǎn)染miR-control、miR-186-5p mimics、XIST 表達(dá)載體和miR-186-5p mimics+XIST 表達(dá)載體，培養(yǎng)72 h。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示：與Control組相比，XIST組OD值明顯增高，miR-186-5p組OD值明顯降低，miR-186-5p+XIST組OD值低于Control組，高于miR-186-5p組。提示過(guò)表達(dá)miR-186-5p顯著抑制A549細(xì)胞活性，抑制過(guò)表達(dá)XIST促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖作用(圖9)。

10 miR-186-5p抑制XIST促進(jìn)細(xì)胞的侵襲作用 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示：與Control組相比，XIST組每視野細(xì)胞數(shù)明顯增加，miR-186-5p組每視野細(xì)胞數(shù)明顯減少，miR-186-5p+XIST組每視野細(xì)胞數(shù)少于XIST組，多于miR-186-5p組。提示過(guò)表達(dá)miR-186-5p顯著降低A549細(xì)胞侵襲能力，抑制過(guò)表達(dá)XIST促進(jìn)A549細(xì)胞的侵襲作用(圖10)。

注：四組比較，*P<0.05

注：四組比較，*P<0.05

討 論

近年來(lái)隨著人類對(duì)基因的研究及基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已證實(shí)大多數(shù)基因組可轉(zhuǎn)錄為RNA，僅1%～2%可以編碼蛋白質(zhì)，因此可將全部RNA分為蛋白質(zhì)編碼RNA和蛋白質(zhì)非編碼RNA(ncRNA)[9]。目前人類對(duì)于長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)的研究相對(duì)較少，但目前研究[10]已經(jīng)證實(shí)LncRNAs其結(jié)構(gòu)特異性和堿基特異性可通過(guò)與核酸或蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)基因表達(dá)能力進(jìn)行調(diào)節(jié)。據(jù)了解，人類基因組幾乎都可轉(zhuǎn)錄 LncRNA，其與編碼基因相比有著不同的轉(zhuǎn)錄方向[11]。最近研究[12-13]證實(shí)LncRNA扮演著干擾轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)蛋白活性、誘導(dǎo)染色體重塑、改變細(xì)胞或蛋白結(jié)構(gòu)等細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，可通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA剪接及表觀遺傳調(diào)控等分子機(jī)制在癌癥中發(fā)揮促癌或抑癌作用，與包括惡性腫瘤在內(nèi)的眾多種疾病密切相關(guān)。此外，Jang等[14]研究表明，肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移癌中LncRNA ATB高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞器官定植，誘導(dǎo)上皮至間質(zhì)的侵襲。Jia等[15]研究指出，LncRNA H19異常表達(dá)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平誘導(dǎo)肝癌、肺癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，且可降低人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的耐藥。而Wan等[4]研究發(fā)現(xiàn)在表觀遺傳學(xué)上LncRNA PVT1可通過(guò)調(diào)控 LATS2的表達(dá)促進(jìn)NSCLC的增殖。可見(jiàn)對(duì)LncRNAs在NSCLC中的分子作用機(jī)制進(jìn)行研究可為其臨床治療提供新的思路。

1991年LncRNA XIST被首次研究發(fā)現(xiàn)，指出XIST參與X染色體滅活的啟動(dòng)階段。既往研究再次證實(shí)乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌等眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與XIST相關(guān)，XIST參與細(xì)胞的全部過(guò)程，影響腫瘤的增殖和侵襲。是否可以推測(cè)LncRNA XIST在NSCLC中發(fā)揮著相同作用。因此，本研究首先采用RT-PCR法檢測(cè)NSCLC細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系中XIST表達(dá)是否差異，發(fā)現(xiàn)NSCLC系中XIST高表達(dá)。通過(guò)轉(zhuǎn)染XIST siRNA敲降細(xì)胞系中XIST表達(dá)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞系中XIST表達(dá)水平顯著降低。為研究LncRNA XIST是否參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，研究中通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell 實(shí)驗(yàn)和 Western blot實(shí)驗(yàn)，探究了敲降LncRNA XIST表達(dá)對(duì)NSCLC惡性生物學(xué)行為的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)敲降XIST表達(dá)后，NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲能力顯著降低，其細(xì)胞中增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)含量也明顯降低，研究證實(shí)敲降LncRNA XIST表達(dá)可顯著抑制NSCLC的增殖及侵襲。

研究指出NSCLC中LncRNA UCA1通過(guò)靶向調(diào)控miR-193a-3p表達(dá)發(fā)揮促癌作用。miR-18a的表達(dá)可激活降低結(jié)直腸癌中LncRNA CASC2的表達(dá)。以上研究均指出LncRNAs和miRNAs間存在相互作用。為驗(yàn)證NSCLC中LncRNA XIST是否同樣可作為ceRNA參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合NSCLC的miRNA既往研究成果，檢索篩選出與LncRNA XIST存在結(jié)合位點(diǎn)的miR-186-5p進(jìn)行探究，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲降XIST表達(dá)后，NSCLC細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)升高。經(jīng)構(gòu)建轉(zhuǎn)染miR-186-5p mimic和inhibitor檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRNA XIST與miR-186-5p間存在相互抑制關(guān)系。根據(jù)LncRNA XIST與miR-186-5p可能存在的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建包含miR-186-5p在內(nèi)的XIST野生型和突變型基因報(bào)告載體，利用熒光素霉基因?qū)嶒?yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證兩者間的調(diào)控關(guān)系和調(diào)控方式，發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞中miR-186-5p直接調(diào)控XIST，XIST是miR-186-5p的靶向基因，而miR-186-5p以Ago2依賴方式調(diào)控XIST表達(dá)。營(yíng)救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-186-5p可逆轉(zhuǎn)XIST對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲作用。

綜上所述，LncRNA XIST在NSCLC中高表達(dá)，LncRNA XIST通過(guò)調(diào)控 mi R-186-5p表達(dá)水平影響NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲，XIST可作為其臨床治療的新靶點(diǎn)。