朱美霖，白宏英

1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科(濟(jì)寧 272000)；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(鄭州450000)

腦缺血后的血管再生可有效改善缺血半暗帶的血液供應(yīng)，增加營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的輸送，為新生神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持，并促進(jìn)腦缺血恢復(fù)。腦缺血發(fā)生后雖可以代償性生成新生血管，建立側(cè)枝循環(huán)，仍不能完全代償腦缺血損傷[1]。因此腦缺血后盡快恢復(fù)血供，可以明顯改善預(yù)后。Kusano等[2]研究表明Sonic Hedgehog(SHH)信號通路可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)、血管生長素(Angiogenin,ANG)合成促進(jìn)血管再生。Renault 等[3]發(fā)現(xiàn)SHH信號通路可促進(jìn)毛細(xì)血管形態(tài)的發(fā)生，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。在大鼠腦缺血模型中可觀察到SHH信號通路的激活，另外有研究表明在糖尿病外周神經(jīng)病變的大鼠模型中加入外源性SHH蛋白可促進(jìn)血管再生[4]。為進(jìn)一步研究SHH信號通路與血管再生的影響，本次研究采用Purmorphamine作為SHH信號通路的激活劑，Cyclopamine作為SHH信號的抑制劑來調(diào)控SHH信號通路，以了解SHH信號通路對腦缺血大鼠血管新生的影響。

材料與方法

1 材 料 Purmorphamine粉劑購于上海凱試公司，Cyclopamine購于美國Sigma公司，VEGF抗體、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)兔抗鼠多克隆抗體購于美國SANTA CRUZ公司，免疫組化相關(guān)試劑盒及PCR相關(guān)試劑盒購于德國QIAGEN公司。

2 實驗動物及分組 選取健康清潔級成年SD雄性大鼠120只，體重約為260～320 g，該實驗動物由河南省實驗動物中心提供。將選中的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=30)、模型組(n=30)、激動劑組(PM組，n=30)、抑制劑組(CYC組，n=30)。其中模型組、激動劑組、抑制劑組按時間點(diǎn)再分成三個亞組，每個亞組10只大鼠。模型組、激動劑組于術(shù)后腹腔注射Purmorphamine溶液，抑制劑組于術(shù)后腹腔注射Cyclopamine溶液，剩余分組給予同等劑量的DMF溶液腹腔注射。

3 試劑配備 Purmorphamine粉劑使用前先給予二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解，粉劑全部溶解后加入PBS溶液進(jìn)行稀釋。Cyclopamine粉劑使用前給予DMSO溶劑溶解，然后給予PBS溶液進(jìn)行稀釋。將配備好的溶液冰箱儲存，使用前提前拿出進(jìn)行復(fù)溫。

4 模型制備 采用改良線栓法制作SD大鼠永久性腦缺血模型[2]。各組大鼠給予水合氯醛腹腔注射麻醉，室溫保持 37 ℃。模型組及給藥組給予分離頸總動脈及頸內(nèi)動脈，夾閉頸總動脈，距離分叉處4 mm插入制備好的線栓，將線栓插入大腦中動脈，固定線栓，縫合。術(shù)中大鼠體溫保持37 ℃，術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)。參照Zea longa評分標(biāo)準(zhǔn)于大鼠清醒后6 h、24 h、72 h對造模大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。其中1～3分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血視為造模成功。不符合評分標(biāo)準(zhǔn)剔除，取同批次補(bǔ)足，以保證每個亞組10只大鼠。

5 免疫組化法和微血管密度 于造模給藥結(jié)束后按照既定的時間點(diǎn)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，4%甲醛快速心臟灌洗，斷頭取腦固定24 h備用，經(jīng)過石蠟包埋后，切成4 μm厚度的切片。每只大鼠冰凍切片隨機(jī)抽取5張，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行免疫組化染色、DAB顯色和封片。采用圖像測量分析軟件測定VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)表達(dá)的平均光密度(MOD)。根據(jù)Longa等[5]改良血管計數(shù)法，染色棕黃且與周圍周圍細(xì)胞分界清楚作為一個計數(shù)單位，計算CD34微血管密度、微血管數(shù)。

6 PCR測定缺血半暗帶區(qū)域膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(GLI1)mRNA的表達(dá)情況 10%水合氯醛麻醉，取出腦組織，液氮冷藏后放置于-80℃冰箱。取皮層腦組織100 mg，按照說明書提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成相互補(bǔ)的cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增建立PCR反應(yīng)體系。GLI1上游引物為：5’-TATGTTCTGGCTGCTGCTGTTG-3’下游引物為5’-TGACGCATTGCTGAATCTAA-3’。其中擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃變形30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。將擴(kuò)增好的產(chǎn)物及Maker進(jìn)行電泳，使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，試驗中以β-actin為內(nèi)參，GLI1的擴(kuò)增片段長度為170 bp，計算GLI1相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1 大腦皮質(zhì)半暗帶區(qū)CD34新生微血管密度 CD34陽性細(xì)胞大部分分布在缺血半暗帶區(qū)。PM組新生血管密度較模型組、CYC組明顯增多，三組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CYC組新生血管密度較模型組、CYC組明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠腦組織新生血管密度表達(dá)

2 缺血皮層區(qū)VEGF的表達(dá) 胞質(zhì)中沉著棕黃色顆粒即為VEGF陽性表達(dá)，VEGF表達(dá)主要集中在損傷皮層及缺血周圍。模型組6 h可見VGFE表達(dá)升高，72 h最多。PM組VEGF的表達(dá)量較模型組、CYC組明顯增多，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CYC組VEGF的表達(dá)量較PM組、模型組明顯減少，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2(圖1)。

表2 大鼠腦組織VEGF的表達(dá)

3 FGF的表達(dá) FGF陽性細(xì)胞常見于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等，模型組6 h FGF弱表達(dá)，72 h表達(dá)最多。PM組FGF的表達(dá)量較模型組、CYC組明顯增多，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且CYC組FGF的表達(dá)量較PM組、模型組明顯減少，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3(圖2)。

表3 大鼠腦組織FGF的表達(dá)

4 PCT檢測GLI1的表達(dá) 與模型組相比較，PM組各時間點(diǎn)GLI1的表達(dá)量較前明顯增多(P<0.05)，與模型組相比較，CYC組各時間點(diǎn)GLI1的表達(dá)量較前明顯減少。見表4。

表4 大鼠腦組織 GLI1的表達(dá)

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：PM組；D：CYC組

討 論

在腦缺血性疾病中，神經(jīng)血管單元因為缺氧缺血出現(xiàn)壞死凋亡，影響神經(jīng)功能恢復(fù)，因此及時恢復(fù)血供，促進(jìn)血管新生成為研究治療的熱點(diǎn)。早期研究表明SHH信號通路與胚胎發(fā)育有關(guān)，近期研究表明SHH信號通路在血管再生起著重要作用[6]。Kusano 等[4]發(fā)現(xiàn) SHH信號通路誘導(dǎo)局部缺血組織血管再生，且誘導(dǎo)血管新生的能力強(qiáng)于VEGF。在參與血管再生的過程中，SHH信號通路可以通過依賴GLI的通路、PI-3激酶通路進(jìn)行調(diào)控[7]。SHH信號通路中通過smo蛋白與ptch結(jié)合激活下游基因GLI轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。GLI鋅指家族轉(zhuǎn)錄因子包含GLI1、GLI2、GLI3，其中GLI1的表達(dá)在SHH信號通路中扮演了啟始開關(guān)的角色。GLI1是目前發(fā)現(xiàn)的最能反映 SHH信號通路激活的指標(biāo)[8]。因此本次研究選取測定GLI1的表達(dá)反映通路是否被激活。

Purmorphamine作為SHH信號通路的激活，是一種小分子的嘌呤物，可以透過血腦屏障。Purmorphamine與SMO蛋白結(jié)合改變其空間構(gòu)象從而激活SHH信號通路。本研究顯示PM組在腦缺血6 h后GLI1的表達(dá)量較假手術(shù)組、模型組有明顯升高，24 h達(dá)高峰，72 h仍維持在較高水平，這就表明腹腔注射Purmorphamine可以外源性激活SHH信號通路。Cyclopamine是SHH信號通路的抑制劑，作用位點(diǎn)為SMO蛋白，可改變SMO蛋白構(gòu)象使SMO蛋白失活，抑制SHH信號通路。有研究表明SHH信號通路在腦缺血急性期可被激活，阻斷內(nèi)源性激活的SHH信號通路可加重腦缺血。本次研究中模型組6 h后GLI的表達(dá)開始升高，表明在腦缺血急性期存在內(nèi)源性激活。腹腔注射Cyclopamine后該組GLI1的表達(dá)量與模型組、PM組相比較有明顯降低，說明激活的SHH信號通路被Cyclopamine抑制，從而阻斷下游基因的表達(dá)。

內(nèi)皮血管生長因子VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管通透性因子，可以誘導(dǎo)其毛細(xì)血管新生，并且特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)血管新生、側(cè)支循環(huán)的建立。有研究表明VEGF基因治療缺血性疾病可促進(jìn)缺血組織器官的血管重建,改善缺血組織供血,為缺血性疾病的治療開辟了一條嶄新的途徑[9]。ANG是新生血管構(gòu)建過程中重要的組成成分,在構(gòu)建新生血管過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[10-11]。SHH信號通路可誘導(dǎo) VECs 分化、增殖和遷移，促進(jìn)毛細(xì)血管管腔形成[12]，VEGF被認(rèn)為是SHH信號通路的下游靶基因。堿性成纖維因子FGF可以促進(jìn)血管基底細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分裂，還能通過分泌膠原酶降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜，從而促進(jìn)血管再生[13]。SHH信號通路可通過誘導(dǎo) FGF 表達(dá)，促進(jìn)血小板衍生生長因子及ANG的表 達(dá)，間 接 誘 導(dǎo) 血 管 新 生[14-15]。本研究中模型組、PM組的各時間點(diǎn)VEGF、FGF的表達(dá)量較前假手術(shù)組、CYC組明顯增多，說明不管內(nèi)源性激活SHH信號通路，還是外源性激活SHH信號通路，均可上調(diào)VEGF、FGF的表達(dá)促進(jìn)血管再生。并且PM組新生血管密度、VEGF、FGF的表達(dá)量較其余組明顯增多，而CYC組的新生血管密度、VEGF、FGF的表達(dá)量較其他組減少，這就說明腹腔注射Purmorphamine可激活SHH信號通路上調(diào)VEGF、FGF的表達(dá)促進(jìn)血管再生。腹腔注射Cyclopamine后可抑制SHH信號通路下調(diào)VEGF、FGF的表達(dá)抑制血管再生。

總之通過本實驗研究表明激動SHH信號通路可上調(diào)VEGF、FGF的表達(dá)促進(jìn)血管再生，反之抑制SHH信號通路下調(diào)VEGF、FGF的表達(dá)抑制血管再生，SHH信號通路調(diào)控腦缺血后血管再生中起著重要作用。但是SHH信號通路對血管再生的作用機(jī)制、外源性激活SHH信號通路持續(xù)效應(yīng)如何以及與其他通路是否有交叉作用等問題仍需要進(jìn)一步研究。