楊 娜，吳航利，王 佳，管融資，雷 忻*

(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2.延安市生態(tài)恢復(fù)重點實驗室，陜西 延安 716000)

內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)，是一種通過干擾體內(nèi)激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運、代謝、結(jié)合或消除等，影響生物或人體內(nèi)生殖、發(fā)育、神經(jīng)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的外源性化學(xué)物質(zhì)[1，2]。

農(nóng)藥作為農(nóng)業(yè)上用于防治病蟲害及調(diào)節(jié)植物生長的化學(xué)藥劑，大部分屬于內(nèi)分泌干擾物、極具代表性，而且以具有高效低毒、能被生物降解的特點被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中[3，4]。從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來看，雖然農(nóng)藥的廣泛使用對農(nóng)作物的病蟲草害起到了明顯控制作用，提高了糧食產(chǎn)量，但是由于農(nóng)作物抗藥性增加導(dǎo)致長期、大量噴打農(nóng)藥，對周圍環(huán)境造成了嚴(yán)重影響。同時，我國作為世界上最大的農(nóng)藥使用國之一，隨著農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品以及農(nóng)田周圍水體、大氣和土壤內(nèi)都存在大量農(nóng)藥殘留，這也給動物、人類健康造成了很大的影響[5，6]。近年來許多研究表明，農(nóng)藥對動物及人體具有內(nèi)分泌干擾作用，尤其會導(dǎo)致動物生殖腺損傷、繁殖率降低等問題。故了解農(nóng)藥對動物生殖系統(tǒng)的干擾機(jī)制很有必要。

1 農(nóng)藥對動物生殖腺的影響

生殖腺作為動物產(chǎn)生生殖細(xì)胞和分泌性激素的器官，對于動物的生長發(fā)育繁殖起著至關(guān)重要的作用。農(nóng)藥類EDCs在環(huán)境中的暴露，會導(dǎo)致動物生殖系統(tǒng)發(fā)育異常。從器官、組織、細(xì)胞水平來看，農(nóng)藥會導(dǎo)致動物性腺發(fā)育異常、生殖器官畸形、生殖細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，引起動物生殖系統(tǒng)內(nèi)分泌紊亂[7，8]。Parlak研究發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯(deltamethyrin，DM)暴露下斑馬魚存活率、后代孵化率降低以及致畸概率增加，這主要是由于農(nóng)藥對斑馬魚生殖腺造成影響，表現(xiàn)出卵巢衰竭、卵母細(xì)胞凋亡、子宮頸上皮增生和角質(zhì)化等現(xiàn)象，從而導(dǎo)致子宮功能紊亂，雌激素表達(dá)水平受到抑制[9，10]；同時，DM、多菌靈(carbendazim)暴露下會導(dǎo)致大鼠睪丸生精小管數(shù)減少、磷酸化雄激素受體蛋白表達(dá)量增加，以及雄性白化大鼠睪丸呈管狀變形、腎小管空泡嚴(yán)重變形等[11-13]。

農(nóng)藥還通過影響生殖細(xì)胞周期，來影響生殖細(xì)胞正常增殖和分化，導(dǎo)致生殖細(xì)胞數(shù)目減少，后代質(zhì)量不斷降低。此外，性腺組織的異常進(jìn)一步造成動物繁殖力和繁殖速度減弱，影響后代數(shù)目。研究表明，戴抒豪通過計算L1期暴露時間48 h十氯酮(Kepone，開蓬)的線蟲原代和子代的后代數(shù)目和世代時間，發(fā)現(xiàn)原代線蟲的后代數(shù)目與十氯酮暴露濃度呈反比，子代后代數(shù)目與原代相比有顯著差異，同時中高濃度下世代時間延長較多[14，15]。肖偉洋從組織學(xué)角度分析，高濃度(500 ng/L)三丁基錫(tri-n-butyltin，TBT)暴露下斑馬魚精巢中初級精母細(xì)胞數(shù)量顯著增加，精子數(shù)量顯著減少，并出現(xiàn)嚴(yán)重的空腔化，這可能是因為生殖細(xì)胞發(fā)育被TBT阻斷在初級精母細(xì)胞期[16]。

2 農(nóng)藥對動物生殖相關(guān)基因的干擾機(jī)制

性腺是生物體進(jìn)行生命活動的重要器官，對于卵生動物來說，生殖系統(tǒng)主要是通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus pituitary-gonad，HPG)來調(diào)控的[17-19]。近年來對生物體HPG軸的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥對動物生殖相關(guān)基因的干擾機(jī)制，主要體現(xiàn)在以下幾個方面(圖1)。

圖1 農(nóng)藥對動物生殖相關(guān)基因的影響

2.1 調(diào)控性激素受體應(yīng)答基因

性激素受體主要有雌激素受體(estrogen receptor，ER)與雄激素受體(androgen receptor，AR)，它們起到調(diào)節(jié)生物體生殖下游基因的轉(zhuǎn)錄作用[20]。農(nóng)藥通過調(diào)控性激素受體基因，直接或間接影響性激素受體參與下游調(diào)節(jié)活動，介導(dǎo)信號通路導(dǎo)致生物體HPG軸內(nèi)分泌失調(diào)。在有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱(Chlorpyrifos)暴露實驗中發(fā)現(xiàn)，雌性白化大鼠卵巢內(nèi)erα表達(dá)水平升高，這可能是因為毒死蜱抑制卵母細(xì)胞生長，導(dǎo)致大鼠卵巢上皮細(xì)胞高度、卵泡閉鎖增加以及子宮肌層變厚等組織學(xué)現(xiàn)象，進(jìn)而影響雌激素受體表達(dá)[21，22]。

農(nóng)藥類EDCs通過與性激素受體競爭性結(jié)合，阻止性激素與其受體特異性結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，影響性激素受體基因的正常表達(dá)，直接影響有機(jī)體睪酮(Testosterone，T)和雌二醇(Estradiol，E2)的含量，表現(xiàn)出一定的抗雌激素效應(yīng)或抗雌激素效應(yīng)。通過監(jiān)測三唑錫、三唑酮[23-25]、戊唑醇[26]等三唑類殺菌劑以及三丁基錫[16，27]暴露下的雌性斑馬魚發(fā)現(xiàn)，高濃度下生物體內(nèi)E2下降幅度較大，相關(guān)雌激素基因erα、vtg1(vitellogenin，卵黃蛋白原)、vtg2、ar大量下調(diào)，這可能是因為農(nóng)藥參與了雌激素受體下游基因vtg的表達(dá)，抑制卵黃蛋白原、性激素受體相關(guān)基因表達(dá)量，出現(xiàn)了抗雌激素效應(yīng)[28]。此外，在楊梅的乙草胺對斑馬魚生殖毒性的研究中，還發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥類EDCs會導(dǎo)致生物體表現(xiàn)出一定的抗雄激素效應(yīng)。乙草胺暴露導(dǎo)致斑馬魚性腺系統(tǒng)內(nèi)erα、vtg1、vtg2等生殖相關(guān)基因從最開始上調(diào)到下調(diào)(在整個過程中只經(jīng)歷了七天暴露期)，并顯著下調(diào)卵巢中apgr、ar和腦中ar的表達(dá)量，同時乙草胺對erα的上調(diào)幅度遠(yuǎn)不及對ar的下調(diào)幅度，可見其還會通過競爭性抑制雄激素受體與T結(jié)合表現(xiàn)出抗雄激素效應(yīng)[29，30]。在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)氯農(nóng)藥硫丹暴露下的睪丸切片中基因ar表達(dá)量的顯著下調(diào)，是因為硫丹通過與雄激素受體的Thr877鍵結(jié)合所導(dǎo)致[31]。

2.2 調(diào)控促性腺激素合成相關(guān)基因

農(nóng)藥類EDCs通過調(diào)控腦垂體分泌促性腺激素相關(guān)基因表達(dá)量來降低E2水平，從而影響動物正常生殖活動，其中對于促進(jìn)E2生成的促卵黃激素影響最為顯著。研究表明，甲氧滴滴涕(methoxychlor，MXC)和p，p′-DDT(Dichlorodiphenyltrichloroethane)通過ERK(extracellular regulated protein kinases)途徑來調(diào)節(jié)生物體促性腺激素分泌和基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)fshβ(follicle stimulating hormone，beta polypeptide)、lhβ(luteinizing hormone，beta polypeptide)、cgα表達(dá)水平，刺激垂體細(xì)胞產(chǎn)生促卵黃激素和促黃體激素擾亂生物性腺發(fā)育[32-34]。

此外，馬有寧通過對斑馬魚HPG軸以及肝臟相關(guān)基因表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)三唑類殺菌劑暴露后，雌性斑馬魚促卵黃激素相關(guān)基因fshβ表達(dá)量顯著上調(diào)，促黃體激素基因lhβ的表達(dá)量受到抑制，導(dǎo)致雌激素E2水平下降，進(jìn)而影響性腺發(fā)育[23]。這是因為lhβ基因的下調(diào)抑制了卵母細(xì)胞的成熟，而作為促進(jìn)卵黃和E2生成的fshβ，其上調(diào)是由于農(nóng)藥抑制lhβ表達(dá)量，降低E2水平后的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

2.3 調(diào)控激素合成的關(guān)鍵酶基因

農(nóng)藥類EDCs通過調(diào)控激素合成的關(guān)鍵酶相關(guān)基因，影響生物體內(nèi)性激素水平來干擾生物體性腺系統(tǒng)，包括細(xì)胞色素P450相關(guān)基因、羥基類固醇脫氫酶基因等。研究表明，乙草胺通過下調(diào)斑馬魚羥基固醇脫氫酶合成關(guān)鍵基因hsd17b1(17β-hydroxtsteroid dehydrogenase1)、hsd17b3(17β-hydroxtsteroid dehydrogenase3)，抑制17β-羥基固醇脫氫酶活性[29]，從而介導(dǎo)HPG信號通路，抑制生物體內(nèi)雄烯二酮(androstenedione，ASD)向雌二醇(E2)和睪酮(T)轉(zhuǎn)化，降低生物體內(nèi)E2和T的含量。此外，久效磷農(nóng)藥通過活化蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)通路上調(diào)虹鱒魚性腺細(xì)胞內(nèi)P450相關(guān)基因cyp11a1、cyp17a1表達(dá)量，誘導(dǎo)芳香化酶基因cyp19a上調(diào)[35]；三氯生(Triclosan，TCS)暴露下斑馬魚芳香化酶基因cyp19a、cyp19b表達(dá)量顯著增加，導(dǎo)致芳香化酶活性顯著提高從而影響E2和T的合成[36，37]。從個體水平來看，生物體內(nèi)重要酶活性紊亂，生物體代謝水平、生殖生長發(fā)育、后代存活率都會受到影響。

2.4 干擾生殖細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因

農(nóng)藥類EDCs會通過干擾生殖細(xì)胞增殖、分化相關(guān)基因表達(dá)量，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步影響后代。研究表明，肖偉洋通過研究TBT暴露對斑馬魚生殖細(xì)胞影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)雄魚精巢生殖細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)幅度明顯，尤其是與精母細(xì)胞增殖相關(guān)基因cyclind1、pcna表達(dá)量顯著下調(diào)，減數(shù)分裂相關(guān)基因aldh1α2、sycp3、dmc1顯著上調(diào)[16，38]。即TBT通過影響斑馬魚雄魚精巢生殖細(xì)胞增殖分化、減數(shù)分裂過程阻斷生殖細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致精子數(shù)量減少，生物體繁殖能力降低。這一過程是因為TBT通過調(diào)控細(xì)胞凋亡內(nèi)源促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白(bax/bcl-2)和外源途徑(tnfrsfla/tnfrsflb)相關(guān)基因，增加生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量[39-41]。此外，Xu在秀麗隱桿線蟲的研究中還發(fā)現(xiàn)，硫丹通過氧化壓力激活hus-1、cep-1參與的細(xì)胞凋亡通路，導(dǎo)致線蟲生殖細(xì)胞相關(guān)基因vasa、dazl顯著下調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致生殖細(xì)胞大量凋亡、染色體突變[42]。

3 結(jié)論與展望

為探討農(nóng)藥類EDCs對動物體生殖基因的分子調(diào)控機(jī)制，本文通過總結(jié)和分析農(nóng)藥類EDCs對動物生殖系統(tǒng)的影響發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥的暴露導(dǎo)致動物生殖器官畸形、生殖細(xì)胞數(shù)量減少和質(zhì)量降低、繁殖能力下降，隨著劑量和時間的變化，這些生殖損傷會愈演愈烈；從分子水平來看，主要是通過調(diào)控性激素受體基因、抑制激素合成的關(guān)鍵酶基因等途徑介導(dǎo)HPG信號通路傳導(dǎo)。

目前，存在以下三方面的問題值得深思：一是大量研究表明農(nóng)藥類EDCs會導(dǎo)致動物生殖相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生改變，但農(nóng)藥對這些生殖相關(guān)基因和類固醇激素的調(diào)控機(jī)制仍需要細(xì)化。其中，外源物質(zhì)對動物體色變化、致畸效應(yīng)、信號通路介導(dǎo)機(jī)制(如cAMP/PKA、SF-1、SPE信號通路等)都值得深入研究；二是農(nóng)藥類EDCs的遺傳毒性在動物后代中的累積情況，會在多大程度上導(dǎo)致后代的存活率、孵化率、適合度發(fā)生改變，以及對后代影響程度的定量分析；三是為了更好的解釋農(nóng)藥類EDCs在動物體內(nèi)的富集規(guī)律，就需要考慮這些污染物的生物特性、來源、傳遞規(guī)律等問題，進(jìn)行高效、高質(zhì)量評估。在今后的研究中，需要深入探索農(nóng)藥類EDCs對動物生殖系統(tǒng)的影響機(jī)制、內(nèi)分泌干擾機(jī)制，細(xì)化信號通路傳導(dǎo)機(jī)制、生殖相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制等，在定性研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展定量研究，在定量研究中不斷深化、標(biāo)準(zhǔn)化，為更好的控制環(huán)境污染、保護(hù)生態(tài)環(huán)境。