李天一，于蘭，張波

(石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

新型冠狀病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia，簡(jiǎn)稱新冠肺炎)，是由COVID-19病毒感染導(dǎo)致的肺炎，傳染性強(qiáng)，傳播范圍廣，給社會(huì)帶來(lái)巨大影響。目前臨床常用西醫(yī)治療方案為抗微生物抗病毒藥物為主糖皮質(zhì)激素為輔，體外膜肺氧合治療，重要臟器功能支持的對(duì)癥治療，中醫(yī)藥辯證治療也取得了良好療效[1]。但是尚無(wú)針對(duì)COVID-19的特異性藥物的報(bào)道。

COVID-19是一種β冠狀病毒，遺傳物質(zhì)是單股正鏈RNA，病毒顆粒呈圓形或橢圓形并有包膜，包膜上存在蛋白棘突?？刂乒跔畈《緩?fù)制復(fù)合物活性的主蛋白酶Mpro在病毒生命周期中有重要作用，Mpro與小核糖核酸病毒3C蛋白酶具有相似的切割位點(diǎn)特異性，這一酶通常稱作3CL蛋白酶[2]。病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過(guò)程的兩個(gè)關(guān)鍵多蛋白水解依賴Mpro及其同源酶，由于在冠狀病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中的重要性，Mpro受到研究者的青睞[3]。部分研究者也關(guān)注其RNA聚合酶及解旋酶[4]。對(duì)從5名患者中獲得的COVID-19進(jìn)行全基因組測(cè)序已經(jīng)證實(shí)COVID-19與SARS-CoV有85%的相似性且COVID-19與SARS-CoV病毒都通過(guò)病毒包膜上S蛋白與宿主細(xì)胞膜表面血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體結(jié)合[5]；這些巧合使得有關(guān)SARS-CoV的相關(guān)研究成果應(yīng)用于COVID-19成為可能。對(duì)SARS-CoV藥物研究主要集中在其S蛋白及其受體蛋白ACE2上[6]。

目前，COVID-19引發(fā)的肺炎疫情主要集中在防控方面，對(duì)于中輕度患者，肺部損傷容易受到救治，而對(duì)于肺損傷嚴(yán)重的重度患者，除肺組織實(shí)變外，還容易發(fā)生細(xì)菌感染，特別是金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌，最終引發(fā)肝、腎等多器官衰竭[7]。

相對(duì)2003年SARS-CoV病毒疫情的高爆發(fā)，雖然COVID-19引起的肺炎疫情受到了更好的控制，但特異性治療藥物缺乏仍是一大問(wèn)題。洛匹那韋與利托那韋已被用于臨床新冠肺炎的治療中，但由于目前的治療藥物副作用大，尋找新的安全特異性抗新冠病毒藥物迫在眉睫。本研究通過(guò)大數(shù)據(jù)分析，收集匯總臨床抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，抗金黃色葡萄球菌及抗肺炎鏈球菌藥物，潛在天然小分子化合物，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)篩選特異性作用COVID-19病毒主蛋白酶Mpro及人受體ACE2的有關(guān)藥物，為研究潛在抗COVID-19病毒藥物和治療疫情提供一定參考，為COVID-19疫苗研制爭(zhēng)取時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 藥物信息來(lái)源

臨床現(xiàn)有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，抗金黃色葡萄球菌藥物，抗肺炎鏈球菌藥物及天然小分子化合物來(lái)源于OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)，CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)及文獻(xiàn)挖掘；化合物基本信息來(lái)源于Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過(guò)Cytoscape 3.6.1軟件建立抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物-抗金黃色葡萄球菌藥物-抗肺炎鏈球菌藥物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，通過(guò)Network Analyzer插件分析抗新冠肺炎藥物的接近向量中心度(closeness centrality)，利用Cytoscape軟件尋找能夠同時(shí)抗病毒及細(xì)菌的關(guān)鍵藥物，用于下一步分子對(duì)接分析[8]。

1.3 分子對(duì)接與評(píng)分

COVID-19主蛋白酶Mpro晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自上海藥物研究所及上?？萍即髮W(xué)(PDB ID:6LU7)，使用SYBYL-X 2.0將篩選出的關(guān)鍵化合物與COVID-19主蛋白酶Mpro及關(guān)鍵受體ACE2進(jìn)行虛擬分子對(duì)接及評(píng)分。將化合物模型通過(guò)Surflex-Dock(默認(rèn)設(shè)置采樣了統(tǒng)治彈性)對(duì)接到晶體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)模型中，然后通過(guò)Surflex-Dock評(píng)分功能評(píng)分[9]，分?jǐn)?shù)如下:對(duì)接>0.5被認(rèn)為一般;對(duì)接的分?jǐn)?shù)>4.0被認(rèn)為有效;對(duì)接的分?jǐn)?shù)>6.0被認(rèn)為微摩爾級(jí)別有效[10]。綜合得分為兩項(xiàng)評(píng)分之和。

2 結(jié)果

2.1 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物與關(guān)鍵蛋白的分子對(duì)接及評(píng)分

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)得到抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物24個(gè)，分別與COVID-19主蛋白酶Mpro及關(guān)鍵受體ACE2進(jìn)行分子對(duì)接及評(píng)分。與COVID-19主蛋白酶Mpro評(píng)分>6.0的有效藥物，有奈非那韋、氨苯那韋、阿巴卡韋、洛匹那韋，分子對(duì)接結(jié)果如圖1所示。與關(guān)鍵受體ACE2評(píng)分超過(guò)>6.0的有效藥物見(jiàn)表2，有帕羅霉素、馬拉維洛克、洛匹那韋、利托那韋、氨苯那韋、紫杉醇、阿昔洛韋，分子對(duì)接結(jié)果如圖2。其中洛匹那韋與利托那韋已用于臨床新冠肺炎治療中，被本研究用作陽(yáng)性對(duì)照。

表1 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物與COVID-19主蛋白酶Mpro結(jié)合分?jǐn)?shù)

表2 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物與ACE2受體結(jié)合分?jǐn)?shù)

圖2 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物與ACE2蛋白分子(綠色)對(duì)接(Score>4.0)

2.2 關(guān)鍵抗菌抗病毒藥物篩選及其與關(guān)鍵蛋白的分子對(duì)接及評(píng)分

由于COVID-19病毒引發(fā)的肺炎易出現(xiàn)金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌感染。因此，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)收集臨床抗金黃色葡萄球菌藥物10個(gè)及肺炎鏈球菌藥物29個(gè)，具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒作用的藥物345個(gè)，使用Cytoscape 3.6.1軟件制作網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒、抗金黃色葡萄球菌、抗肺炎鏈球菌至少兩種作用的關(guān)鍵藥物分子19個(gè)見(jiàn)圖3。將這19個(gè)藥物分子進(jìn)行分子對(duì)接及評(píng)分。與COVID-19 Mpro分子評(píng)分>6.0的有效藥物見(jiàn)表3，奧司他韋、西司他丁和利福平，分子對(duì)接結(jié)果如圖4所示。與關(guān)鍵受體ACE2評(píng)分>6.0的有效藥物有西司他丁、泰拉萬(wàn)星見(jiàn)表4，分子對(duì)接結(jié)果如圖5所示。

圖3 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物與抗金黃色葡菌、肺炎鏈球菌藥物的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表3 關(guān)鍵藥物與COVID-19主蛋白酶Mpro結(jié)合分?jǐn)?shù)

圖4 關(guān)鍵藥物與COVID-19主蛋白酶Mpro結(jié)合分?jǐn)?shù)(Score>4.0)

表4 關(guān)鍵藥物與ACE2受體結(jié)合分?jǐn)?shù)

圖5 關(guān)鍵藥物與ACE2受體結(jié)合分?jǐn)?shù)(Score>4.0)

2.3 具有抗菌抗病毒的臨床天然小分子化合物與關(guān)鍵蛋白的分子對(duì)接及評(píng)分

基于文獻(xiàn)挖掘技術(shù)找到較強(qiáng)抗病毒抗菌活性的幾種天然小分子化合物紫草素、穿心蓮內(nèi)酯、黃芩素、姜黃素、金絲桃素、苦參素、沒(méi)食子酸、木犀草素、秋水仙堿及莽草酸，并進(jìn)行分子對(duì)接及評(píng)分。與COVID-19 Mpro評(píng)分>6.0的有效分子有紫草素、穿心蓮內(nèi)酯(表5)，分子對(duì)接結(jié)果如圖6所示。與關(guān)鍵受體ACE2評(píng)分>6.0的有效分子有姜黃素、紫草素(表6)，分子對(duì)接結(jié)果如圖7、圖8所示。

表5 天然小分子化合物與COVID-19主蛋白酶Mpro結(jié)合分?jǐn)?shù)

表6 天然小分子化合物與ACE2受體結(jié)合分?jǐn)?shù)

圖6 天然小分子化合物與COVID-19 Mpro結(jié)合分?jǐn)?shù)(Score>4.0)

圖7 天然小分子化合物與ACE2受體結(jié)合分?jǐn)?shù)(Score>4.0)

圖8 對(duì)Mpro和ACE2受體結(jié)合綜合評(píng)分較高藥物

3 討論

新型冠狀病毒COVID-19引發(fā)的肺炎是一種具有高傳染性的疾病，整體死亡率為3.06%，遠(yuǎn)低于SARS-CoV，但傳染性相當(dāng)，基本傳染數(shù)R0值在2.2到3.9之間[11-12]。疫情爆發(fā)造成人員死亡和經(jīng)濟(jì)停滯不前，所面臨的嚴(yán)峻形勢(shì)要求醫(yī)療界做出快速反應(yīng)，但傳統(tǒng)藥物研發(fā)往往需要幾個(gè)月甚至幾年時(shí)間，不能快速應(yīng)對(duì)爆發(fā)性疾病。肺炎疫情急需疫苗研發(fā)、中藥防治、抗病毒藥物等多個(gè)方面協(xié)同解決，尋找有效抗COVID-19病毒化合物迫在眉睫[13]。因此通過(guò)對(duì)現(xiàn)有藥物和從天然小分子庫(kù)中尋找到的具有抗病毒的小分子化合物進(jìn)行研究，能夠?qū)Σ《疽呙绲难兄乒ぷ鲙?lái)一定的啟示和指導(dǎo)作用。

Mpro酶在病毒生命周期中的重要性使其成為在抗冠狀病毒藥物研制中的重要靶點(diǎn)[14]。COVID-19 Mpro在此次疫情中也得到了重點(diǎn)關(guān)注。COVID-19病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞始于病毒表面S蛋白與細(xì)胞表面靶受體ACE2結(jié)合，在細(xì)胞膜融合后將病毒核衣殼傳遞到細(xì)胞內(nèi)以進(jìn)行復(fù)制[15]。以病毒表面的S蛋白為目標(biāo)尋找靶向抗體，對(duì)病毒產(chǎn)生被動(dòng)免疫，是目前研究人員的一種思路[16]，但是抗體需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在人群中大規(guī)模測(cè)試以評(píng)估抗體的有效性和覆蓋范圍，該方案是一個(gè)緩慢而且復(fù)雜的過(guò)程[17]；另一種思路是不直接針對(duì)病毒糖蛋白，而是針對(duì)細(xì)胞膜表面的病毒受體蛋白作為靶點(diǎn)發(fā)揮中和作用，從而阻止病毒與其結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞[18]。此次疫情爆發(fā)時(shí)間短，病毒無(wú)法突變產(chǎn)生新的宿主結(jié)合受體。宿主ACE2蛋白不會(huì)產(chǎn)生突變，因此不用擔(dān)心藥物分子的脫靶效應(yīng)。與宿主ACE2蛋白特異性結(jié)合的藥物分子具有非常好的臨床應(yīng)用前景。

COVID-19病毒是一種RNA病毒，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找目前臨床抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，并與COVID-19病毒主蛋白酶Mpro及病毒作用受體ACE2進(jìn)行分子對(duì)接評(píng)分。藥物分子與蛋白質(zhì)受體結(jié)合成構(gòu)象時(shí)，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，則能量越低，越容易發(fā)揮藥效。本研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物對(duì)COVID-19主蛋白酶Mpro與ACE2受體均有良好作用的藥物有馬拉維洛克(5.5449，8.8294)、奈非那韋(8.3068，5.7834)、洛匹那韋(6.0549，7.6403)、氨苯那韋(6.6190，6.9776)、利托那韋(5.9897，7.3957)、帕羅霉素(3.97，9.1036)(圖8)。洛匹那韋與利托那韋已作為國(guó)家衛(wèi)建委發(fā)布的新冠肺炎防治方案中的治療藥物[1]，二者被報(bào)道是SARS Mpro特異性抑制劑[19]，洛匹那韋與利托那韋均能夠和SARS、COVID-19 S蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ACE2受體[20]，阻斷病毒進(jìn)一步識(shí)別和侵入宿主過(guò)程。阿巴卡韋已被上海藥物研究所公布可能對(duì)COVID-19有治療作用。根據(jù)對(duì)接評(píng)分預(yù)測(cè)臨床抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物可能有效的有馬拉維洛克、奈非那韋和氨苯那韋。

隨著感染的進(jìn)行，患者易被金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌感染，導(dǎo)致病情加重，且廣譜抗菌藥和糖皮質(zhì)激素似乎對(duì)肺炎疫情并沒(méi)有特別好處[1,21]。因此本研究積極尋找具有抗病毒作用且能抑制肺炎鏈球菌或金黃色葡萄球菌的藥物進(jìn)行分子對(duì)接并預(yù)測(cè)評(píng)分。最終發(fā)現(xiàn)與Mpro和ACE2受體都有良好作用的藥物有西司他丁(7.2541，7.4961)、奧司他韋(7.5041，5.7571)。根據(jù)對(duì)接評(píng)分預(yù)測(cè)，與臨床現(xiàn)有抗病毒藥物洛匹那韋(6.0549，7.6403)與利托那韋(5.9897，7.3957)相比，潛在有效治療藥物為西司他丁和奧司他韋。臨床常將亞胺培南與西司他丁聯(lián)用，以保持倆者在體內(nèi)的活性。

天然小分子化合物作為藥物開(kāi)發(fā)的前體和中藥材中發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。與COVID-19 Mpro和ACE2評(píng)分超過(guò)良好的小分子有紫草素(7.0913，6.6184)、姜黃素(5.4938，7.215)穿心蓮內(nèi)酯(6.0547，4.9049)。與洛匹那韋(6.0549，7.6403)與利托那韋(5.9897，7.3957)相比，潛在的有效治療作用的小分子是紫草素和姜黃素。紫草素和姜黃素的抗炎抑菌抗病毒活性被廣泛報(bào)道[22]。此外，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染有特殊療效[23]。因此富含紫草素、姜黃素和穿心蓮內(nèi)酯的中藥材可能在治療新冠肺炎中起到重要作用。

ATC code (Anatomical Therapeutic Chemical)系統(tǒng)是一種根據(jù)藥物作用的器官或系統(tǒng)以及如何作用而分配給藥物的獨(dú)特代碼，是WHO對(duì)藥品的官方分類系統(tǒng)。在ATC code分類系統(tǒng)中，活性物質(zhì)被分為五個(gè)不同的等級(jí)。ATC代碼第一級(jí)為一位字母，表示解剖學(xué)副族，第二級(jí)為兩位數(shù)字，表示治療學(xué)副族。第三級(jí)為一位字母，表示藥理學(xué)副族。第四級(jí)為一位字母，表示化學(xué)副族。第五級(jí)為兩位數(shù)字，表示化合物[24]。ATC code系統(tǒng)有助于減少不同國(guó)家和地區(qū)因語(yǔ)言和政策原因?qū)λ幤访Q產(chǎn)生的分歧，指導(dǎo)合理用藥。ATC code系統(tǒng)可用于收集整理各種環(huán)境來(lái)源的藥物使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[25]。本文收集37個(gè)臨床藥物，從解剖學(xué)上看，一級(jí)分類J屬于全身使用的抗感染藥，27種；從治療學(xué)上看，二級(jí)分類05抗菌藥(17種)和01抗病毒藥物占大類(11種)。提示在外科手術(shù)輔助呼吸基礎(chǔ)上，臨床抗菌抗病毒藥物依然是治療COVID-2019的主要藥物。

本文在當(dāng)前對(duì)COVID-19研究有限的情況下，將重點(diǎn)放在可快速測(cè)試，有大量?jī)?chǔ)備并且能夠廣泛應(yīng)用的臨床現(xiàn)有藥物和天然小分子，通過(guò)分子對(duì)接的方式預(yù)測(cè)對(duì)COVID-19可能有治療作用的藥物，并提出幾種潛在有效藥物：1)除臨床已經(jīng)使用的洛匹那韋與利托那韋外[1]，阿巴卡韋、馬拉維洛克、奈非那韋和氨苯那韋可能有效；2)除已發(fā)布于防治手冊(cè)上的藥物奧司他韋外，亞胺培南西司他丁(泰能)聯(lián)合可能有效。亞胺培南西司他丁具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，在臨床上用于嚴(yán)重細(xì)菌感染、多種細(xì)菌聯(lián)合感染和耐藥菌株感染，但由于廣譜抗菌藥物可能加重新冠肺炎，因此亞胺培南與西司他丁的使用應(yīng)該經(jīng)過(guò)更全面的研究與探索，從而決定是否具有抗新冠病毒的作用。3)富含天然小分子化合物紫草素、姜黃素及穿心蓮內(nèi)酯的中藥方劑可能有效。對(duì)病毒Mpro和ACE2受體阻斷藥物的研究不僅能夠治療已被感染的患者，還可以作為潛在的預(yù)防手段，保護(hù)一線醫(yī)務(wù)人員遠(yuǎn)離COVID-19的危害，加速下一步疫苗和藥物的研發(fā)。

致謝：感謝上海藥物研究所及上海科技大學(xué)分享COVID-19病毒Mpro晶體結(jié)構(gòu)，感謝華東理工大學(xué)唐赟教授課題組在分子對(duì)接上的支持。