袁東芳

肉雞養(yǎng)殖中奇異變形桿菌的分離鑒定及其16S rRNA基因序列分析

袁東芳

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

為監(jiān)測(cè)商品肉雞養(yǎng)殖過(guò)程中奇異變形桿菌的攜帶情況，從山東7個(gè)不同地區(qū)的12個(gè)商品肉雞場(chǎng)采集雞泄殖腔棉拭子516份，根據(jù)菌落形態(tài)特征，革蘭氏染色，傳統(tǒng)的生化反應(yīng)以及16SrRNA基因序列測(cè)序分析，分離鑒定出奇異變形桿菌61株，攜帶陽(yáng)性率為11.82%。通過(guò)聚類(lèi)分析、序列比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從分子水平上證明分離菌株均為奇異變形桿菌，進(jìn)一步表明不同地區(qū)的奇異變形桿菌存在親緣性，但奇異變形桿菌的親緣關(guān)系與地理分布關(guān)系不大。

肉雞場(chǎng) 奇異變形桿菌 分離鑒定 16S rRNA

奇異變形桿菌(Proteus mirabillis，PM)屬于腸桿菌科變形桿菌屬，系無(wú)莢膜、無(wú)芽胞，有鞭毛、有菌毛的革蘭陰性桿菌，為條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力較低時(shí)容易引起發(fā)病，多為繼發(fā)感染，可引起泌尿系統(tǒng)感染、腹瀉、菌血癥和食物中毒等[1-2]。奇異變形桿菌作為一種人畜共患病，在自然界分布極廣，人類(lèi)、家畜及家禽的帶菌率極高，應(yīng)該引起足夠重視[3]。近年來(lái)，我國(guó)山東、河南、河北、四川、廣西等地不斷有雞群暴發(fā)奇異變形桿菌病，尤其是在季節(jié)更替、環(huán)境改變、轉(zhuǎn)群和混合感染其他病原時(shí)，雞群抵抗力下降，病情加重，病死率升高，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4, 5]。

目前報(bào)道的奇異變形桿菌基本是從發(fā)病或病死的畜禽中分離的，為了監(jiān)測(cè)商品肉雞場(chǎng)在養(yǎng)殖過(guò)程中奇異變形桿菌的攜帶情況，有效防止奇異變形桿菌病的暴發(fā)，本文自2017年6月至2018年6月，從山東7個(gè)不同地區(qū)的12個(gè)商品肉雞場(chǎng)采集雞泄殖腔棉拭子516份，經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定及16Sr RNA基因序列測(cè)序分析[6]，分離鑒定出奇異變形桿菌61株，攜帶陽(yáng)性率為11.82%。將不同地區(qū)分離菌株的16SrRNA基因序列以99%一致性[7]進(jìn)行聚類(lèi)分析，獲得12條代表序列并進(jìn)行分析。分析結(jié)果從分子水平證明分離菌株均為奇異變形桿菌。為養(yǎng)殖過(guò)程中奇異變形桿菌攜帶情況的監(jiān)測(cè)，奇異變形桿菌病的臨床診斷、鑒定和有效防制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品 商品肉雞泄殖腔拭子516份，來(lái)自于山東7個(gè)不同地區(qū)，分別是寒亭區(qū)123份、昌邑市137份、安丘市80份、萊西市62份、平度市105份、萊陽(yáng)市82份、濰城區(qū)60份；

1.2 主要試劑 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、SS瓊脂培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營(yíng)養(yǎng)肉湯、革蘭氏染色液均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司； A306細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PCR試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及純化 將采集的泄殖腔拭子置于SC增菌液中，37℃，180r/m，培養(yǎng)24h，觀(guān)察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，SC增菌液呈紅色渾濁狀態(tài)，挑取菌液劃線(xiàn)于SS平板，培養(yǎng)24h，觀(guān)察菌落特征，挑取可疑菌落于NA平板上分區(qū)劃線(xiàn)，純化培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃，180r/m，培養(yǎng)24h。

1.4 細(xì)菌的生化鑒定 挑取單個(gè)菌落接種于A(yíng)306細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，37℃，培養(yǎng)24h，觀(guān)察記錄結(jié)果。

1.5 16S rRNA基因擴(kuò)增及序列測(cè)定 用試劑盒提取分離菌的DNA為模板，用細(xì)菌16srRNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序后，利用NCBI網(wǎng)站中Blast檢索系統(tǒng)對(duì)測(cè)序得到的16srRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析；對(duì)在Genbank中檢索到的國(guó)內(nèi)不同地域來(lái)源的奇異變形桿菌，通過(guò)Muscle比對(duì)，運(yùn)用Fasttree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離及染色 分離菌株在SS平板上呈圓形隆起、邊緣整齊、無(wú)色透明、橘黃色或中心黑色的中等大小菌落，在NA上呈擴(kuò)散性生長(zhǎng)，以接種點(diǎn)為中心形成波紋狀同心環(huán)，布滿(mǎn)整個(gè)平板。鏡檢可見(jiàn)分離菌為革蘭氏陰性，呈桿狀、球桿狀、球狀或短鏈狀，表現(xiàn)多形性，主要以桿狀為主。分離出的61株菌分別命名，寒亭區(qū)18株分別為H1-H18，昌邑區(qū)4株分別為C1-C4，安丘市9株分別為A1-A9，萊西市8株分別為L(zhǎng)1-L8，平度市11株分別為P1-P11，萊陽(yáng)市5株分別為Y1-Y5，濰城區(qū)2株分別為W1-W2。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)對(duì)照A306細(xì)菌微量生化反應(yīng)管編碼鑒定手冊(cè)，分離菌的生化特性顯示該61株分離菌均為奇異變形桿菌。

附表 分離菌的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果判定生化試驗(yàn)結(jié)果判定生化試驗(yàn)結(jié)果判定 靛基質(zhì)-枸櫞酸鹽+棉籽糖- VP-尿素酶+戊糖- 苯丙氨酸+硫化氫+山梨醇- 賴(lài)氨酸-磷酶-側(cè)金盞花醇- 鳥(niǎo)氨酸+ONPG-二磷酶-