陳福艷 覃雅 歐陽賢華 陳福彩 梁萬文 雷愛瑩 黎建斌

摘?要：為了篩選無乳鏈球菌敏感藥物，對9種常用漁藥抗生素進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行測定，通過加入阿爾瑪藍(lán)指示劑和革蘭氏染色顯微鏡觀察，得出各抗菌藥物的最低抑菌濃度依次為：恩諾沙星0.3 μg/mL，氟苯尼考0.3 μg/mL，阿莫西林5.2 μg/mL，諾氟沙星0.9 μg/mL，強(qiáng)力霉素0.9 μg/mL，慶大霉素13.0 μg/mL，林可霉素17.6 μg/mL，新霉素22.0 μg/mL，磺胺嘧啶133.3 μg/mL。結(jié)果表明，恩諾沙星和氟苯尼考對無乳鏈球菌最敏感，殺菌力最強(qiáng);在試驗(yàn)過程中，阿爾瑪藍(lán)指示劑有助于抑菌結(jié)果的判斷。

關(guān)鍵詞：羅非魚;無乳鏈球菌;藥敏試驗(yàn)

羅非魚（Oreochromis spp.）種類繁多，養(yǎng)殖較多的品種有吉富羅非魚 （Oreochromis niloticus）、奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O. aureus）、紅羅非魚（Oreochromis mossambi-cus×O. niloticus）等品種[1]。羅非魚具有生長快，食性雜，無肌間刺，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[2]，廣受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛。隨著生活水平的提高，人們更加注重健康生活和環(huán)境保護(hù)，要求“少污染，多健康和高效益”，因此對水產(chǎn)養(yǎng)殖工作者提出了更高的要求。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大規(guī)模發(fā)展過程中，常受細(xì)菌疾病的侵害，其中由無乳鏈球菌引起的細(xì)菌病在每年的7-10月份爆發(fā)頻繁。兩廣地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖場曾出現(xiàn)大批羅非魚發(fā)病、死亡，給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[3]。部分羅非魚感染鏈球菌后會出現(xiàn)魚眼球混白或者突出，體表發(fā)黑，肝、腎和脾等組織敗血等癥狀，嚴(yán)重影響羅非魚生長、存活率以及經(jīng)濟(jì)效益[4]。

臨床上常規(guī)應(yīng)對羅非魚細(xì)菌病防疫和治療措施主要是施加相應(yīng)的抗生素，但近年來抗生素類藥物使用不規(guī)范，引起抗藥性和耐藥性等問題[5]，病害治療效果不佳，常發(fā)生持續(xù)性死亡，且難于根除;羅非魚患病后，飼料投喂量下降，影響魚的生長速度。因此對無乳鏈球菌病的防治工作迫在眉睫，有必要開展該菌的藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感的防治藥物，為臨床羅非魚鏈球菌病的防治提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株來源?床菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保種的無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，NO：180623）.

1.1.2?實(shí)驗(yàn)藥物?試驗(yàn)篩選了9種常用漁用抗生素：林可霉素、阿莫西林、磺胺嘧啶、慶大霉素、諾氟沙星（已禁用）、新霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素;這些藥物均為北京鑫洋水產(chǎn)科技有限公司贈送的原粉。

1.1.3?實(shí)驗(yàn)儀器?電子天平、96孔培養(yǎng)板、移液器、恒溫?fù)u床、50 mL離心管、酒精燈、分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、JA5003N電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、優(yōu)普超純水器。

1.1.4?培養(yǎng)基?TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨 17 g，大豆胨 3 g，葡萄糖 2.5 g，NaCl 5 g，K2PO4 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?溶液配制?按參考文獻(xiàn)[6]的方法并根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)配制9種抗菌藥物的母液，他們依次為：林可霉素200 μg/mL、阿莫西林200 μg/mL、磺胺嘧啶450 μg/mL、慶大霉素100 μg/mL、新霉素50 μg/mL、諾氟沙星10 μg/mL、恩諾沙星2 μg/mL、氟苯尼考2 μg/mL、強(qiáng)力霉素2 μg/mL。用超純水配制母液濃度，完全溶解、攪拌均勻，用022 μm過濾器除雜除菌，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

甘油20 mL，0.1%阿爾瑪藍(lán)（刃天青）溶液20 mL，配置完成后用0.22 μm過濾器過濾除菌，放置4 ℃冰箱保存。

配制TSA培養(yǎng)基1 L，121 ℃高壓滅菌，冷卻，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?肉湯稀釋法

1.2.2.1?接種物的制備?將實(shí)驗(yàn)菌株（NO：180623）活化后進(jìn)行液體培養(yǎng)，接種完成后放到37 ℃搖床（100 r/min） 培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行稀釋，用分光光度計(jì)測量菌液濃度，將菌液濃度稀釋成1×105 cfu/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2.2?抗菌藥物濃度稀釋?參考預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最大濃度，將已滅菌的96孔培養(yǎng)板放置在超凈工作臺上進(jìn)行無菌操作，按2/3倍數(shù)濃度梯度稀釋后，得出11個(gè)濃度梯度組。

1.2.2.3?菌液接種?在96微孔板上每一行的第1孔中加入相應(yīng)稀釋一定濃度后的抗菌藥物300 μL，用8道移液槍吸取肉湯培養(yǎng)基100 μL加入第2～12孔，將第1孔藥液吹打均勻后吸取200 μL至第2孔，接著將第2孔藥液吹打均勻后吸取200 μL藥液至第3孔，以此類推直至第11孔時(shí)，吸除200 μL;第12孔作為空白對照，加入100 μL稀釋好的菌液（1×105 cfu/mL）。為了更好地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入10 μL藍(lán)色阿爾瑪藍(lán)和10 μL甘油。每種藥物4個(gè)平行。加樣完成后，密封96微孔板，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，連續(xù)觀察指示劑變化[7]。

1.2.2.4?結(jié)果判斷方法?結(jié)果判斷采用肉眼觀察與顯微觀察相結(jié)合。肉眼觀察即根據(jù)顏色變化和渾濁度來判斷是否生長細(xì)菌。當(dāng)空白對照孔（第12孔）為紅色時(shí)，即為有效檢測，反之則無效，需重新實(shí)驗(yàn)。以96微孔板上藍(lán)色的最低藥物濃度判斷為最低抑菌濃度（MIC），紅色孔判斷為不能殺死或抑制細(xì)菌生長濃度。顯微觀察即取各濃度組里的培養(yǎng)液進(jìn)行革蘭氏染色與油鏡顯微觀察，以不生長細(xì)菌的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

2?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即根據(jù)阿爾瑪藍(lán)指示劑在12 h的培養(yǎng)時(shí)間里顏色從青藍(lán)，到紅紫，最后粉紅的這個(gè)變化過程，判斷9種抗菌藥物對無乳鏈球菌的影響程度，得到各種藥物最小抑菌濃度為：恩諾沙星0.3 μg/mL，氟苯尼考0.3 μg/mL，阿莫西林5.3 μg/mL，諾氟沙星0.9 μg/mL，強(qiáng)力霉素0.9 μg/mL，慶大霉素13.0 μg/mL，林可霉素17.6 μg/mL，新霉素22.0 μg/mL，磺胺嘧啶133.3 μg/mL。

進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用革蘭氏染色后油鏡顯微觀察，9種藥物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肉眼觀察結(jié)果一致。可見兩種最小抑菌濃度判斷結(jié)果一致，阿爾瑪藍(lán)可作為藥敏結(jié)果判斷的指示劑。

3?討論

魯晶娣等[8]采用紙片藥敏試驗(yàn)方法對來源于柳州不同地區(qū)的20株無乳鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明不同來源菌株對同一種藥物敏感性存在差異。而本試驗(yàn)只選用一株無乳鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，盡管本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行四組平行，該菌株的最低抑菌濃度可能與不同來源的無乳鏈球菌存在差異，因此本試驗(yàn)結(jié)果僅供參考，具體用藥還需了解當(dāng)?shù)爻靥恋挠盟幨?，盡量錯(cuò)開用藥，同時(shí)嚴(yán)格遵守藥物使用規(guī)范。研究還表明20株無乳鏈球菌中對同種藥物敏感性有差異，結(jié)果如表2所示，這些抗菌類藥物敏感性分析可為養(yǎng)殖者提供參考。

梁志凌等[9]采用瓊脂擴(kuò)散法的牛津杯法研究82種中草藥對無乳鏈球菌的抑菌活性。結(jié)果表明，其中抑菌能力最強(qiáng)的七種中草藥及其抑菌圈分別為：黃連（40 mm±2.1 mm） 、五倍子 （36 mm±1.9 mm）、紅藤（27 mm±0.9 mm） 、大蒜（27 mm±0.8 mm） 、北五味子（26 mm±1.1 mm） 、夏枯草（25 mm±1.6 mm） 、艾葉（25 mm±1.4 mm），這些結(jié)果為防治無乳鏈球菌篩選中草藥提供參考。

無乳鏈球菌在病害防治過程中，往往采用抗生素和中草藥配伍的防治方法，抗生素達(dá)到快速殺滅病菌，中草藥殺菌能力相對較弱但具有提高身體免疫力的作用，因此兩者相結(jié)合是當(dāng)前常用的治療方法。但在抗生素與中草藥結(jié)合用藥時(shí)要注意藥物之間的協(xié)同作用與拮抗作用，具體有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 程世亮，劉新風(fēng)，鄭文，等.魚類無乳鏈球菌病[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（2）：105-109.

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[9] 梁志凌 ，馬艷平 ，馬江耀，等 .82種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) ，2016，43（10）：128—133.

（收稿日期：2020-04-21）