(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000)

心腦血管疾病具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，是全世界威脅人類健康的重要原因之一[1]。過去20年來，中國心腦血管疾病死亡率急劇上升[2]。心腦血管疾病的主要病因之一是動(dòng)脈粥樣硬化，大量研究顯示，高脂血癥、高血壓及糖尿病等多種因素與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。瘦素是由肥胖基因編碼的蛋白類激素，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理功能[5]。多項(xiàng)研究表明，瘦素具有多種致動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6-7]。目前研究已證實(shí)，活性氧(ROS)能夠加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]。然而，瘦素是否能夠通過調(diào)控ROS水平在動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用的研究報(bào)道甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)以人腦血管平滑肌細(xì)胞(HBVSMCs)為研究對(duì)象，探究瘦素對(duì)HBVSMCs細(xì)胞活性及ROS水平的影響，為臨床上治療動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管疾病提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

HBVSMCs由四川大學(xué)華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供；重組人瘦素由美國Preprotech公司提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和Ki-67抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗盒購自美國Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自南京凱基科技發(fā)展有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HBVSMCs復(fù)蘇后，培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、100 mg/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放置在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每2 d更換1次新的培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁生長，待細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)以胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的HBVSMCs以胰酶消化，并接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞單層融合時(shí)除去舊培養(yǎng)液，更換成含不同濃度(0、10、100、1 000 μg/L)瘦素的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，將含0 μg/L瘦素的培養(yǎng)液培養(yǎng)的HBVSMCs作為對(duì)照組(A組)，分別將含10、100、1 000 μg/L瘦素的培養(yǎng)液培養(yǎng)的HBVSMCs作為瘦素低、中、高濃度組(B、C、D組)。各組HBVSMCs作用48 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長期的HBVSMCs，用胰酶消化后接種到96孔板中，分組并處理24、48和72 h，每組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別向各孔細(xì)胞中加20 μL的CCK-8溶液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀分別測(cè)定各組細(xì)胞450 nm波長處光密度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。

1.3.2Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平 收集處理48 h后各組HBVSMCs，加入細(xì)胞裂解液在冰上提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在蛋白中加入適量上樣緩沖液，在沸水浴中加熱變性，取等量蛋白樣品上樣，行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)濃縮膠底部斷開電源，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜放置在含50 g/L脫脂奶粉的封閉液中孵育1 h。TBST洗膜后加入相應(yīng)一抗，PCNA和Ki-67一抗均為1∶1 000稀釋，4 ℃過夜孵育；TBST洗膜后加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜后加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，顯影后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，采用Image J軟件處理圖像，以β-actin為內(nèi)參照，分別分析各組HBVSMCs中PCNA和Ki-67蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 瘦素處理48 h后，各組HBVSMCs以胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，洗滌細(xì)胞2次，向細(xì)胞中加入1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇溶液，4 ℃固定24 h，PBS洗滌細(xì)胞后加入500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，再向細(xì)胞懸液中加入PI染液25 μL、RNase A 10 μL，37 ℃避光染色30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞，以Modfit軟件分析各組HBVSMCs周期。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4DCFH-DA探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平各組HBVSMCs處理48 h后收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照ROS檢測(cè)試劑盒說明書要求測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，即將DCFH-DA熒光染料以無血清培養(yǎng)液稀釋成10 μmol/L工作液濃度，加入到收集的細(xì)胞中混勻，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育1 h，反應(yīng)結(jié)束后以培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，以熒光強(qiáng)度表示ROS水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 瘦素對(duì)HBVSMCs增殖活性的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時(shí)均明顯升高(F=117.818、160.349，P<0.001)；與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時(shí)均明顯升高(q=8.356～18.800，P<0.05)；與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組HBVSMCs活性在處理48和72 h時(shí)均明顯升高(q=10.445、8.235，P<0.05)；在瘦素處理24 h時(shí)各組HBVSMCs活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別244872(t/h)A組0.22±0.020.52±0.020.73±0.03B組0.21±0.02 0.58±0.02* 0.81±0.03*C組0.23±0.02 0.66±0.03*& 0.89±0.03*&D組0.22±0.02 0.76±0.04*&# 0.98±0.04*&#

與對(duì)照組比，*F=117.818、160.349，P<0.001；與瘦素低濃度組比，&q=8.356～18.800，P<0.05；與瘦素中濃度組比，#q=10.445、8.235,P<0.05。

2.2 瘦素對(duì)HBVSMCs中PCNA和Ki-67表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達(dá)水平明顯上調(diào)(F=290.000、898.769，P<0.001)；與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達(dá)水平明顯上調(diào)(q=13.064～52.842，P<0.05)；與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達(dá)水平均明顯上調(diào)(q=17.146、26.901，P<0.05)。見圖1。

A：對(duì)照組，B：瘦素低濃度組，C：瘦素中濃度組，D：瘦素高濃度組。多組比較，F(xiàn)=290.000、898.769，P<0.001；與對(duì)照組比，*P<0.05；與瘦素低濃度組比，&P<0.05；與瘦素中濃度組比，#P<0.05。

圖1 Western blot檢測(cè)HBVSMCs中PCNA和Ki-67的表達(dá)水平

2.3 瘦素對(duì)HBVSMCs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，瘦素低、中、高濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比明顯降低(F=264.180，P<0.05)，S期和G2/M期細(xì)胞百分比明顯升高(F=160.033、380.234，P<0.05)；與瘦素低濃度組相比較，瘦素中、高濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比明顯降低(q=10.091、25.696,P<0.05)，S期和G2/M期細(xì)胞百分比均明顯升高(q=5.838～26.203,P<0.05)；與瘦素中濃度組比較，瘦素高濃度組G0/G1期細(xì)胞百分比明顯降低(q=15.605,P<0.05)，S期和G2/M期細(xì)胞百分比明顯升高(q=11.530、16.507，P<0.05)。見圖2。

A：對(duì)照組，B：瘦素低濃度組，C：瘦素中濃度組，D：瘦素高濃度組。多組比較，F(xiàn)=160.033～380.234，P<0.001；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與瘦素低濃度組比較，&P<0.05；與瘦素中濃度組比較，#P<0.05。

圖2 瘦素對(duì)HBVSMCs細(xì)胞周期的影響

2.4 瘦素對(duì)HBVSMCs內(nèi)ROS水平的影響

DCFH-DA探針法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、瘦素低濃度組、瘦素中濃度組、瘦素高濃度組ROS水平分別為13.25±1.16、17.33±1.46、35.49±3.86和67.88±6.18。與對(duì)照組相比較，瘦素低、中、高濃度組HBVSMCs內(nèi)ROS水平明顯升高(F=394.025，P<0.001)；與瘦素低濃度組比較，瘦素中、高濃度組HBVSMCs內(nèi)ROS水平明顯升高(q=14.487、40.326,P<0.05)；與瘦素中濃度組相比較，瘦素高濃度組HBVSMCs內(nèi)的ROS水平明顯升高(q=25.839，P<0.05)。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病是全世界人類最主要的死亡原因，目前已成為全球性公共衛(wèi)生問題[9]。近年來，隨著人類生活習(xí)慣的改變、生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，多項(xiàng)研究結(jié)果表明，內(nèi)皮損傷炎癥反應(yīng)是造成動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因[10-12]。血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖能夠?qū)е卵鼙诎l(fā)生病理變化，造成血管內(nèi)膜損傷，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[13]。瘦素是一類廣泛分布在體內(nèi)的多肽類，由脂肪組織分泌，參與調(diào)節(jié)多種心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。報(bào)道指出，瘦素能夠上調(diào)人和小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[15]。近期已有研究結(jié)果顯示，瘦素能夠促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病中發(fā)揮作用[16]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的瘦素干預(yù)HBVSMCs，CCK-8檢測(cè)顯示，瘦素能夠呈濃度依賴性地促進(jìn)HBVSMCs的增殖活性，這與以往關(guān)于瘦素促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的結(jié)果相符[17-19]。此外，本實(shí)驗(yàn)還通過Western blot檢測(cè)HBVSMCs中PCNA和Ki-67表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示，PCNA和Ki-67的表達(dá)水平均隨瘦素干預(yù)濃度的升高而上調(diào)。PCNA和Ki-67作為增殖細(xì)胞核抗原，是反映細(xì)胞處于增殖狀態(tài)的指標(biāo)[20]。本文結(jié)果提示，瘦素通過上調(diào)PCNA和Ki-67的表達(dá)促進(jìn)HBVSMCs的增殖活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，瘦素能夠降低G0/G1期細(xì)胞比例，提高S期和G2/M期細(xì)胞比例。這說明經(jīng)瘦素處理后，HBVSMCs進(jìn)入S期和G2/M期的細(xì)胞增多，細(xì)胞增殖加快，提示瘦素能夠加快HBVSMCs周期進(jìn)程來促進(jìn)細(xì)胞增殖。這與周偉強(qiáng)等[21]的瘦素能促進(jìn)乳癌MDA-MB-231細(xì)胞周期進(jìn)程的結(jié)果相符。

近年來，越來越多的研究結(jié)果表明氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22-24]。ROS是氧化應(yīng)激啟動(dòng)的關(guān)鍵因子，當(dāng)體內(nèi)積累過多的ROS時(shí)將導(dǎo)致機(jī)體氧化與抗氧化的失衡，最終引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激可通過兩方面誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的形成：一方面是通過氧化作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)產(chǎn)生毒害作用，影響大分子物質(zhì)的生物功能；另一方面是通過激活相應(yīng)的信號(hào)通路引起血管結(jié)構(gòu)和功能的破壞[25]。目前研究結(jié)果顯示，瘦素在乳房健康和惡性腺上皮細(xì)胞中通過NADPH氧化酶5誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，激活細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。本實(shí)驗(yàn)通過DCFH-DA探針法檢測(cè)瘦素干預(yù)對(duì)HBVSMCs內(nèi)ROS水平的影響，結(jié)果顯示，瘦素能夠呈濃度依賴性地誘導(dǎo)ROS的表達(dá)。這與先前的研究結(jié)果相符[27-29]。如YU等[30]研究結(jié)果顯示，瘦素能夠誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，該過程能夠被熊果酸抑制。還有研究結(jié)果顯示，瘦素可能通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，參與高血壓動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)過程[31]。這些研究提示，瘦素可能通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

綜上所述，瘦素能夠促進(jìn)HBVSMCs增殖活性并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探究瘦素在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究初步探究瘦素對(duì)HBVSMCs增殖活性、周期進(jìn)程及ROS表達(dá)的影響，但未對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)其補(bǔ)充。并且瘦素對(duì)HBVSMCs凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為是否存在影響尚不清楚，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)也將對(duì)此進(jìn)行探究。