(青島大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266100)

骨質(zhì)疏松具有骨微觀結(jié)構(gòu)退行性改變、骨量減少和骨密度降低的特點(diǎn)，導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低[1]、骨脆性增加[2]及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[3]，引起了老齡化社會(huì)的廣泛關(guān)注。氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是衰老的重要機(jī)制之一[4]，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為活性氧(ROS)的積聚超過(guò)機(jī)體的清除能力造成DNA損傷、激活氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致衰老及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。ROS在體內(nèi)積聚可激活核因子κB受體活化因子配體(RANKL)信號(hào)通路，導(dǎo)致骨吸收增加。RANKL信號(hào)通路被認(rèn)為是促進(jìn)破骨細(xì)胞活化的主要靶點(diǎn)，可激活多種下游信號(hào)通路[5]，從而促進(jìn)骨吸收和破骨細(xì)胞分化過(guò)程。長(zhǎng)期注射D-半乳糖(D-gal)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生一系列類(lèi)似于自然老化的病理變化，如認(rèn)知障礙、氧化應(yīng)激和骨量減少等[6]。用D-gal誘導(dǎo)建立亞急性衰老模型具有周期短、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于衰老機(jī)制研究和抗衰老藥物篩選。褐藻膠寡糖(AOS)具有較高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等[7]。骨質(zhì)疏松性骨折是導(dǎo)致老年人死亡的主要原因之一[8]，因此骨質(zhì)疏松癥的早期預(yù)防、診斷和治療十分重要，開(kāi)發(fā)更有效的延緩骨質(zhì)疏松癥的藥物具有重要意義。目前大多數(shù)骨質(zhì)疏松研究側(cè)重于絕經(jīng)后婦女，而缺乏對(duì)老年男性骨質(zhì)疏松的研究。故本實(shí)驗(yàn)采用D-gal誘導(dǎo)建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，探討AOS對(duì)衰老雄性小鼠骨質(zhì)疏松的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性C57BL/6J小鼠45只，SPF級(jí)，8周齡，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：12 h晝夜循環(huán)，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)青島大學(xué)動(dòng)物福利和倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且遵守中國(guó)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)制訂的《動(dòng)物保護(hù)與使用指南》。P16小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Mix購(gòu)自Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 45只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組，A組)、模型組(D-gal組，B組)、D-gal+AOS低劑量組(D-gal+AOS-L組，C組)、D-gal+AOS中劑量組(D-gal+AOS-M組，D組)以及D-gal+AOS高劑量組(D-gal+AOS-H組，E組)，每組9只。Control組小鼠頸背部皮下注射滅菌注射用水5 mL/(kg·d)，其余組小鼠頸背部皮下注射D-gal 200 mg/(kg·d)，連續(xù)8周。從D-gal注射第5周開(kāi)始，AOS干預(yù)低、中、高劑量組分別給予AOS 50、100、150 mg/(kg·d)灌胃處理4周，Control組和D-gal組小鼠給予蒸餾水10 mL/(kg·d)灌胃處理4周。

1.2.2骨密度測(cè)量 藥物干預(yù)完成后，取每組各3只小鼠的同側(cè)股骨，采用雙能X線骨密度儀(Dexa；Osteosys Primus，Korea)對(duì)整個(gè)股骨進(jìn)行骨密度測(cè)量(掃描間距1.5 mm，掃描速度60 mm/s)。

1.2.3Western Blot檢測(cè)P16和P67 phox蛋白表達(dá) 藥物干預(yù)完成后，取每組各3只小鼠的股骨組織進(jìn)行液氮研磨，將RIPA裂解液加入研磨好的股骨組織中提取蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍(lán)至分離膠底部時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，凝膠成像系統(tǒng)成像后用Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)股骨組織p47phox、gp91phox和RANKLmRNA的表達(dá) 藥物干預(yù)完成后，取每組各3只小鼠的股骨組織進(jìn)行液氮研磨，加Trizol 50～100 g/L，顛倒混勻室溫放置30 min。4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，加1/5體積氯仿，充分震蕩混勻后置于冰上靜置5 min。4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中。加入與上清等體積的異丙醇，充分震蕩混勻，置于冰上靜置10 min。4 ℃下以12 000 r/min離心10min，棄上清，加體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液懸浮沉淀。4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，吸除上清，自然晾干后加入10 μL DEPC水溶解RNA。用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃、600 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；95 ℃、10 s，65 ℃、60 s,97 ℃、1 s。PCR引物及其序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 PCR引物及其序列

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠股骨骨密度比較

與Control組相比較，D-gal組小鼠股骨骨密度明顯下降；與D-gal組相比較，AOS干預(yù)各組小鼠股骨骨密度明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.853，P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)比較

與Control組相比較，D-gal組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)增加；與D-gal組比較，AOS干預(yù)各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.862、156.943，P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

A：Control組，B：D-gal組，C：D-gal+AOS-L組，D：D-gal+AOS-M組，E：D-gal+AOS-H組。

圖1 各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)的Wes-tern Blot檢測(cè)

組別骨密度P16P67 phoxA組0.670±0.0101.000±0.0001.000±0.000B組0.423±0.0381.503±0.0921.917±0.081C組0.620±0.0101.415±0.0501.043±0.095D組0.677±0.0491.063±0.0130.753±0.071E組0.717±0.0150.567±0.0150.573±0.070

2.3 各組小鼠股骨組織中p47 phox、gp91 phox 和RANKL mRNA表達(dá)比較

與Control組相比較，D-gal組股骨組織中p47phox、gp91phox和RANKLmRNA表達(dá)增加；與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠股骨組織中p47phox、gp91phox和RANKLmRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.373～112.311，P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別p47 phoxgp91 phoxRANKLA組1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000B組2.503±0.1401.804±0.0617.962±0.609C組1.643±0.0871.378±0.2764.135±1.225D組1.138±0.0951.183±0.1631.681±0.172E組0.804±0.1610.848±0.1111.092±0.075

3 討 論

到2050年，65歲以上的老年人口將超過(guò)8億。隨著世界人口平均壽命的延長(zhǎng)，衰老相關(guān)疾病如阿爾茨海默病[9]、骨質(zhì)疏松[10]等的發(fā)病率和死亡率將明顯增加，其造成的社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)也日益加重。骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，導(dǎo)致老年人的死亡率增加。衰老可以引起骨皮質(zhì)和骨小梁的礦化減少、孔隙度增加及骨密度降低等，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。本文研究結(jié)果顯示，D-gal組衰老性骨質(zhì)疏松模型小鼠的股骨骨密度較Control組顯著降低，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠的股骨骨密度顯著增加。說(shuō)明AOS對(duì)D-gal誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松有保護(hù)作用。P16作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子[12]，在衰老和抑制腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用。P16在大多數(shù)嚙齒動(dòng)物和人體組織中的表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而顯著增加[13]。本文結(jié)果顯示，P16蛋白在D-gal組股骨中的表達(dá)增加，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠股骨中P16蛋白的表達(dá)降低，說(shuō)明AOS延緩了D-gal誘導(dǎo)的衰老進(jìn)程。

氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞衰老，而抑制衰老可能是治療骨丟失的有效方法。氧化應(yīng)激與許多年齡相關(guān)疾病(骨質(zhì)疏松、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等)有關(guān)，它可以破壞骨骼系統(tǒng)中骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡，使骨硬度和強(qiáng)度降低，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[14]。ROS的一個(gè)主要來(lái)源是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，它可促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，D-gal組股骨中NADPH氧化酶亞基p67phox、p47phox和gp91phox的mRNA表達(dá)增加，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組股骨中NADPH氧化酶亞基mRNA表達(dá)減少。表明AOS對(duì)衰老性骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用可能與氧化應(yīng)激的抑制有關(guān)。

隨著年齡的增長(zhǎng)，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成之間失去平衡[15]，當(dāng)骨吸收超過(guò)骨形成時(shí)出現(xiàn)骨代謝失衡，引起骨量降低從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。RANKL在破骨細(xì)胞生成中發(fā)揮著重要的作用[16]，可以與核因子κB受體活化因子(RANK)結(jié)合激活信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞活化、分化和成熟等過(guò)程[17]。RANKL相關(guān)信號(hào)通路被認(rèn)為是促進(jìn)骨丟失和破骨細(xì)胞活化的主要靶點(diǎn)[18]。本研究結(jié)果顯示，在衰老性骨質(zhì)疏松D-gal組股骨中RANKLmRNA表達(dá)增加，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠股骨中RANKLmRNA表達(dá)降低，說(shuō)明AOS對(duì)衰老性骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用可能與RANKL通路抑制有關(guān)。

綜上所述，AOS對(duì)D-gal誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠骨質(zhì)疏松有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和破骨細(xì)胞活化抑制有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。