黃忠明

(達州中醫(yī)藥職業(yè)學院，四川 達州 635000)

急性組織損傷后，大量炎癥因子釋放，誘導巨噬細胞、成纖維細胞增生，其中細胞外基質增生會降低組織器官的順應性，伴或不伴組織器官結構改變，將進一步影響器官功能，這一過程被稱作器官重構〔1〕。急性心肌梗死患者梗死后心室重構是由心肌梗死病變導致心室損傷出現(xiàn)的功能與形態(tài)變化過程，心肌細胞損傷后，將引起細胞外基質發(fā)生障礙，打亂心肌排列，導致收縮功能異常，這些均是細胞外基質重構的基礎〔2〕。心肌纖維化是心肌組織細胞外基質大量沉積，導致的膠原容積與膠原濃度增加、各膠原比例失調與排列維紊亂〔3〕。急性心肌梗死患者心室重構與心肌纖維化均會對其心臟功能產生影響，降低心臟順影響，增加心源性猝死風險〔4〕?？梢娔孓D或抑制心肌纖維化與心室重構對治療進行心肌梗死的重要意義。益氣活血組方被胡國恒等〔5〕研究證實對加速缺血心肌血管新生、減輕心肌缺氧缺血情況有著重要價值。但將益氣活血組方用于急性心肌梗死是否能獲得理想效果無較多報道。本研究觀察不同劑量益氣活血組方進行短期治療對急性心肌梗死大鼠心室重構與心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 購入Sprague-Dawley(SD)SPF級大鼠65只，周齡6～8〔平均(7.00±1.00)〕w；體重0.22～0.24〔平均(0.23±0.10)〕kg。本次動物實驗獲得醫(yī)院動物委員會批準，相關操作及處理均符合《關于善待實驗動物指導性意見》〔6〕中相關規(guī)定。

1.2主要試劑 美國Invitrogen公司的胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液、抗生素、臺盼藍，北京益利精細化學品有限公司的二甲苯、甲醛固定液、無水乙醇、水合氯醛、二甲基亞砜，北京貞玉民生藥業(yè)的75%/95%酒精，Sakura Finetechnical公司的包埋劑，瑞士Roche公司的蛋白裂解液。

1.3主要儀器與設備 日本SANYO提供高壓蒸汽滅菌器、制冰機，德國BRAND提供電子移液器，美國Milli-Qufplus提供超純水設備，德國Leica TCS NT正置熒光顯微鏡、組織切片機、烤片機，德國Eppendorf公司提供離心機、微量移液槍，海爾公司常溫冰箱，美國Forma公司低溫冰箱、水浴箱，美國貝克曼公司pH計，美國自然基因有限公司的小動物呼吸機。

1.4建模方法

1.4.1器械準備 制作心肌梗死模型手術用具，包括滅菌手術器械、16號氣管插管套管針、電動備皮刀、注射器、紗布、棉簽、7-0絲線與3-0絲線。

1.4.2制作大鼠心肌梗死模型 對大鼠使用10%水合氯醛0.3 g/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，電動備皮刀備皮，仰臥位，直視下氣管插管，與動物呼吸機連接輔助呼吸，維持正常的呼吸頻率及潮氣量。將大鼠取左側臥位，與心電監(jiān)測連接，常規(guī)消毒鋪巾。依次將大鼠皮膚剪開，將皮下組織與肌肉剝離，在第4肋間進入到胸腔，使用撐開器將胸部撐開，使用棉球擋住肺組織，沿著心底將心包撕開。對前降支走行范圍仔細識別，以肺動脈圓錐與左心耳下緣2 mm左右位置定位標記，對冠脈左前降支縫合結扎，以心臟前壁顏色局部蒼白為宜。后徹底結扎，可以發(fā)現(xiàn)心電圖發(fā)生ST-T波改變，部分可有室性心律失常出現(xiàn)。若左室前壁顏色部分轉為蒼白，且室壁運動減弱，則認為模型建立成功，若無上述表現(xiàn)，可選擇其他部位結扎。建模成功后逐層將胸腔關閉，根據(jù)大鼠的體動反應，脫開氣管插管與呼吸機。嚴密觀察大鼠呼吸，若出現(xiàn)自主呼吸可將氣管插管拔除，并吸入氧氣。

1.4.3大鼠急性心肌梗死模型的篩選 模型制作結束后，使用超聲心動圖進行大鼠急性心肌梗死模型的篩選，將不合格模型剔除，同時測量建模成功大鼠接受治療前的各心電圖相關指標基線值。典型心肌梗死后表現(xiàn)包括左室短軸切面發(fā)現(xiàn)前間壁心肌結構消失、前壁心肌結構消失，運動幅度消失或減低。模型入選標準：①客觀指標：左室射血分數(shù)(LVEF)低于60%；②主觀指標：至少存在一個層面前壁室壁收縮運動異常。同時符合上述2項指征才能看作是建模成功。65大鼠隨機選擇10只作為空白對照組(A組)，其他55只大鼠接受急性心肌梗死建模，最終建模成功50只。

1.5實驗分組與給藥方法 將建模成功的50只大鼠隨機分為5組，分別是模型組(B組)、卡維地洛對照組(C組)、益氣活血組方低劑量組(D組)、益氣活血組方中劑量組(E組)、益氣活血組方高劑量組(F組)，各10只。模型組不給予藥物干預治療，給予C組卡維地洛(福安藥業(yè)集團寧波天衡制藥有限公司，國藥準字H20000101)10 mg/(kg·d)，溶于生理鹽水10 mg/kg中，于每日早晨固定時間直接灌胃給藥。A組、B組則給予等劑量生理鹽水。治療干預在建模成功24 h內開始，持續(xù)14 d。C組、D組、E組給予低至高劑量的益氣活血組方治療，由達州中醫(yī)藥職業(yè)學院附屬醫(yī)院中藥房熬制提供，組方包括黃芪50 g、丹參、川芎各25 g，當歸10 g，藥物浸泡30 min后煎取并濃縮。藥物劑量由低至高為12、24、36 mg/(kg·d)。

1.6主要實驗指標檢測

1.6.1組織取材 組織取材前先對大鼠進行稱重，后麻醉大鼠，將其胸腔剪開，心臟暴露后將心臟取出，使用生理鹽水沖洗，擠出血液，使用濾紙沾干，后稱重，計算大鼠心臟重量指數(shù)(HWI)，即心臟重量比體重(HW/BW)。后由梗死中間橫切心臟，其余心臟使用眼科鑷子剝離棄右室，保留左室，按需分為小份，保存待檢。用于組織病理檢查的組織使用甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋后切片。

1.6.2主要檢測方法 ①采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠心肌細胞結構，胞核、胞質等形態(tài)，蘇木精屬于堿性物質，能夠讓胞核內染色質與胞質內核糖呈藍色；伊紅為酸性，可以讓胞質與胞外成分著色為紅色。②采用Masson染色、天狼星紅染色以判斷大鼠梗死面積與心肌纖維化程度，以膠原纖維藍色著色情況評價心肌纖維化程度，經(jīng)顯微鏡觀察。③心室重構血流動力學與心功能相關參數(shù)的檢測：采用超聲心動圖評價，指標包括LVEF、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末期內徑(LVIDS)、左室重量指數(shù)(LVW/BW)、HW/BW等。

1.7統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析，LSD-t檢驗，χ2檢驗，秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組心室重構與心功能相關參數(shù)水平比較 與A組比較，B組LVFS、LVEF水平顯著降低(P<0.05)，LVIDS水平顯著升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組、F組，LVFS、LVEF水平顯著升高，LVIDS水平顯著降低(P<0.05)，且F組LVFS、LVEF水平最高、LVIDS水平最低，F(xiàn)組與E組、C組與D組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2梗死周圍區(qū)域組織病理結構變化情況 在灌胃后各大鼠心肌均有病理改變出現(xiàn)。經(jīng)HE紅染色結果發(fā)現(xiàn)，同A組相比，各模型組左室發(fā)現(xiàn)明顯的病理生理學改變，梗死邊緣心肌細胞伸長、肥大，左室壁心肌部分凝固性壞死，胞質呈染色呈深染狀；此外，部分發(fā)生心肌細胞變性、腫脹、壞死、溶解，肌原纖維不同程度扭曲，可見不同程度炎性細胞浸潤，心肌纖維出現(xiàn)裂解，有廣泛壞死病變。各治療組治療結束時可以發(fā)現(xiàn)多數(shù)病灶有效稀釋，極個別仍可見少量的炎性細胞浸潤、肌原纖維溶解及纖維組織增生。見圖1。

表1 各組心室重構與心功能相關參數(shù)水平比較

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05；與C組比較:3)P<0.05；與D組比較:4)P<0.05；表2同

2.3各組梗死膠原面積、Ⅰ/Ⅲ型膠原值比較 A組梗死周圍膠原面積、Ⅰ/Ⅲ型膠原值最小，后依次為F組、E組、D組、C組、B組(P<0.001)。C組與D組、E組與F組上述指標組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組梗死周圍膠原面積、Ⅰ/Ⅲ型膠原值比較

3 討 論

心肌纖維化形成的機制復雜，是膠原合成與降解代謝之間失衡的結果，若心力衰竭發(fā)生使心肌細胞與心肌間質細胞流失、心肌成纖維細胞增殖、心肌成纖維細胞表型轉變、成纖維細胞分泌與合成膠原蛋白成分異常，將引起Ⅰ型與Ⅲ型膠原比值變化，加重心肌膠原沉積程度。加之促膠原蛋白降解及基質金屬蛋白酶活性表達下調，在其共同作用下將增加膠原的合成而膠原的降解降低，故而誘發(fā)心肌纖維化〔7～9〕。急性心肌梗死患者心肌纖維化是一個連續(xù)變化的過程，其導致的各區(qū)域室壁變化能夠反映患者心室重構發(fā)生與發(fā)展，故治療急性心肌梗死，應重點改善患者心室重構與心肌纖維化狀態(tài)，對抑制左室進行性擴張與變形、改善心功能意義重大〔10〕。Ⅰ、Ⅲ型膠原中Ⅰ型膠原起到支架的作用與正常功能維持作用，而Ⅲ型膠原則是決定膠原纖維彈性的基本要素〔11〕。本研究各模型組膠原堆積，且Ⅰ型膠原占主導，這會影響室壁彈性，而在給予D組、E組、F組大鼠益氣活血組方治療14 d后，大鼠膠原纖維明顯縮小，且隨著藥物使用劑量的增加，膠原纖維面積縮小情況越好；此外，各組經(jīng)藥物治療的大鼠在治療后，其Ⅰ/Ⅲ型膠原比值降低，室壁代償運動能力提高，且與西藥治療比較，中/高劑量益氣活血組方的應用帶來的治療價值更高。上述結果均表明，益氣活血組方對急性心肌梗死大鼠心肌纖維化有很好的抑制之效，且以中/高劑量藥物的使用更具價值。既往研究指出，中藥單體、復方湯劑、中成藥等對急性心肌梗死大鼠心室重構也有一定作用，甚至可能較西藥的使用更具優(yōu)勢〔12,13〕。本研究結果提示益氣活血組方更利于改善急性心肌梗死大鼠心室重構。益氣活血組方中劑量與高劑量的使用在各療效指標方面比較未見差異，故為了保證治療的安全性，可以優(yōu)先選擇中劑量。益氣活血組方全方有祛瘀生新、益氣活血的效果，全方由當歸、黃芪、丹參、川芎四味藥合制而成，臨床上主要用于急性心肌梗死的氣虛血瘀癥的治療，藥物在使用后能夠幫助患者的臨床癥狀得到顯著改善〔5，14〕。方中黃芪能夠大補元氣，還能滋補宗氣、調和營衛(wèi)，其為君藥〔15〕；當歸作為臣藥使用，能夠活血通絡化瘀〔16〕；丹參為佐藥，可涼血調血活血；川芎為使藥，通經(jīng)活血，走而不守〔17〕。諸藥合之用之，可促元氣恢復，調腸氣血，絡通則病除。

綜上所述，短時間治療干預下，使用中、高劑量的益氣活血組方治療急性心肌梗死更具價值，大鼠心梗后心室重構得到明顯改善，有效抑制心肌纖維化，大鼠心功能受心肌梗死影響減輕。