梅濤 王建設 張纓

摘 要：目的：研究8周有氧運動對骨骼肌microRNA表達的影響，并對差異表達的miRNA進行生物信息學分析以發(fā)現(xiàn)其可能作用途徑，為后續(xù)深入研究運動對骨骼肌產(chǎn)生影響的機制提供方向。研究方法：20只8周齡C57BL/6J小鼠隨機分為安靜組（C）和運動組（E）。運動組預適應訓練一周后，采用坡度0°、12 m/min、60 min/天、5天/周、持續(xù)8周的有氧訓練方案進行跑臺訓練。于訓練48小時后采集小鼠腿部骨骼肌，并提取總RNA，采用miScript miRNA PCR Arrays檢測骨骼肌miRNA的表達;采用DIANA-microT-CDS、TargetScan對差異表達的miRNA進行靶基因預測，Cytoscape Bingo工具對靶基因進行Gene Ontology分析（GO分析），mirPath v.3工具對差異表達的miRNA進行通路分析。研究結(jié)果：1）共發(fā)現(xiàn)58個有氧運動影響骨骼肌差異表達的miRNAs，其中上調(diào)表達的miRNAs有miR-411-5p、miR-340-5p、miR-148b-3p 等，共計44個;下調(diào)表達的miRNAs共有miR-709、miR-1947-3p、miR-667-5p 等14個。2）靶基因預測結(jié)果顯示，上調(diào)表達的miRNA共有9 122個靶基因，下調(diào)表達的miRNAs共有3 636個靶基因。3）GO分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達的miRNA的靶基因GO功能富集主要包括核酸結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、調(diào)節(jié)基因表達、大分子代謝過程等;下調(diào)表達的miRNA的靶基因GO功能富集主要包括核酸結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸代謝過程、轉(zhuǎn)錄過程等。4）miRNA 通路分析結(jié)果顯示，上調(diào)表達的miRNA靶向的通路有MAPK信號通路、mTOR信號通路、破骨細胞分化等;下調(diào)表達的miRNA靶向的通路有糖胺聚糖生物合成 - 硫酸軟骨素信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等。結(jié)論：有氧運動能夠引起骨骼肌內(nèi)miRNA的差異表達;差異表達

關鍵詞：有氧運動;microRNA;骨骼肌;生物信息學分析

Abstract：Objective：To analyze the functions of miRNAs which were affected by 8-week aerobic exercise in skeletal muscle of mice. Methods：Twenty C57BL/6J mice were randomly divided into exercise （E） and control （C） groups. The E group were trained on a treadmill with a program of slope 0°， 12m/min， 60min/day， and 5 days/week. The C group lived normally without training. After 8-week of training， skeletal muscles were harvested for RNA extraction. Subsequently， miScript miRNA PCR Arrays was conducted to identify the differentially expressed miRNAs between two groups. Target gene prediction was performed by using TargetScan and microT-CDS tools. Gene Ontology analysis （GO） on the target gene was performed with Cytoscape Bingo. MirPath v.3 from the DIANA tools was used to execute the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） analyses. Results： A total of 58 miRNAs affecting the differential expression of skeletal muscle were found. 44 miRNAs were upregulated （miR-411-5p， miR-340-5p， miR-148b-3p， etc.） and 14 miRNAs were downregulated （miR-709， miR-1947-3p， miR-667-5p， etc.） after the aerobic exercise. Prediction of target genes showed that there were a total of 9122 target genes for the up-regulated miRNAs， while 3636 target genes for the down-regulated miRNAs. GO analysis revealed that the differentially expressed miRNAs participated in a variety of molecular functions and biological processes including nucleic acid binding， protein binding， regulation of gene expression， macromolecule metabolic process and others. KEGG analysis showed that the up-regulated miRNAs were significantly enriched in MAPK， Wnt and mTOR signaling pathway. The down-regulated miRNAs were mainly enriched in MAPK， Wnt signaling pathway. Conclusion：Differential expression of miRNAs in skeletal muscle could be induced by Aerobic exercise. The physiological and biochemical processes may be regulated by the differentially expressed miRNAs in skeletal muscle by targeting MAPK signaling pathway， Wnt signaling pathway and mTOR signaling pathway， which provide directions for further research.

Key words： Aerobic Exercise; MicroRNA; Skeletal Muscle; Bioinformatics Analysis

骨骼肌是機體重要的動力源，微小RNA （microRNA， miRNA）參與對骨骼肌細胞增殖、分化、肌肉萎縮、骨骼肌重塑、骨骼肌血管再生等的多種生理功能的調(diào)節(jié)作用[1-3]。MiRNA是一類長度約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，其主要的作用是通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯或者降解其mRNA，進而負性調(diào)控動植物細胞內(nèi)的基因表達[4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌特異性miRNA（Muscle-specific microRNAs，myomiRs）對骨骼肌的生理功能的調(diào)控起著十分重要的作用[1]。“運動是良醫(yī)”，一些文獻已報道有氧運動影響增齡或病理性的骨骼肌萎縮、骨骼肌肥大等生理過程[5-7]，也可影響骨骼肌中miRNA的表達水平[8]。然而，有規(guī)律的長期有氧運動會影響哪些miRNA表達，以及這些miRNA在有氧運動中主要介導哪些信號通路的變化，國內(nèi)外未見報道。

因此，本研究以C57BL/6J雄性小鼠為研究對象，觀察8周有氧運動后，小鼠骨骼肌中miRNA的表達變化，并對小鼠骨骼肌中差異表達的miRNA進行生物信息學的分析（包括靶基因預測、GO功能注釋分析和通路分析），從miRNA角度探討有氧運動影響骨骼肌生理過程的可能調(diào)控機制，以期為后續(xù)研究提供方向和生物信息學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康 8 周齡C57BL/6J雄性小鼠（購于維通利華公司實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證書：SCX-K（京）2009-0004）20 只，按體重隨機分為兩組：安靜對照組（C組）和有氧運動組（E組），每組 10 只。小鼠體重（18.37±2.26）g，每籠 3～4 只飼養(yǎng)于北京體育大學動物房，動物房溫度保持在 20℃～25℃，相對濕度保持在 50%～70%，每天光照 12 h（7：00-19：00），各組動物均自由進食和飲水。

1.2 干預方案

C組、E組小鼠正?；\中活動;E組小鼠首先進行1周適應性跑臺訓練，方案為：坡度0°，跑速12 m/min，持續(xù)時間15 min/天，運動頻率5天/周。之后采用正式訓練方案：坡度0°，跑速12 m/min（約75%最大攝氧量強度）[9]，運動強度持續(xù)時間60 min/天，運動頻率5天/周，共8周。

1.3 取材

所有小鼠取材均在8周最后一次運動后48 h進行。小鼠脫頸椎處死，立即取小鼠兩側(cè)腿部骨骼肌，迅速稱量，用錫紙包裹，標記，立刻投入液氮中。然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，保存待用。

1.4 miRNA檢測

取50 mg小腿骨骼肌組織，采用miRNeasy Mini Kit（Qiagen GmbH，德國）提取骨骼肌總RNA。采用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientifc，美國）檢測RNA提取質(zhì)量和濃度。采用miScript II RT Kit（Qiagen GmbH，德國）進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：5× miScript HiSpec Buffer 4μL，10× miScript Nucleics Mix 2 μL，RNase-free water 10.5 μL，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，Template RNA 1.5 μL。采用miScript SYBR Green PCR Kit、miScript miRNA PCR Arrays（Qiagen GmbH，德國）對miRNA進行基于SYBR Green法的real-time qPCR分析。采用ABI7500熒光定量 PCR儀（Thermo Fisher Scientifc，美國）檢測CT值。RT-PCR反應體系為2× QuantiTect SYBR Green Master Mix 12.5 μL， 10x miScript Universal Primer 2.5 μL，RNase-free water 9.8 μL，cDNA 模板 0.2 μL。RT-PCR反應條件為：激活 HotStart DNA Taq 酶95℃ 15 min;變性94℃ 15 s，融合55℃ 30 s，延伸70℃ 30 s，40個循環(huán);添加溶解曲線。使用2-△△CT法計算實驗組相對于對照組的表達差異倍數(shù)。

1.5 miRNA靶基因預測

采用DIANA-microT-CDS和TargetScan在線預測軟件工具對差異表達的miRNA進行靶基因預測。分別預測運動上調(diào)miRNA的靶基因和運動下調(diào)miRNA的靶基因。由于不同的預測工具在算法上存在差異，為增加預測的準確性，選取能同時被這兩個預測工具預測到的基因作為差異miRNA的靶基因。

1.6 Gene Ontology（GO）分析

本研究采用Cytoscape Bingo 插件對靶基因進行GO功能注釋分析。GO是一個國際標準化基因功能分類體系，由基因本體聯(lián)合會所建立，適用于對基因功能進行限定和描述。該體系包含基因分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）、生物過程（Biological Process，BP）等內(nèi)容。通過這三個方面描述miRNA靶基因及其產(chǎn)物具有的分子功能、參與的生物過程以及位于細胞中的位置。

1.7 miRNA通路分析

采用DIANA-mirPath v.3分析工具對差異表達的miRNA進行通路分析，預測miRNA能夠影響的信號通路。該分析工具集成了主流的miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫，輸入差異表達的miRNA，通過計算即可獲得miRNA對應靶基因的信號通路，從而獲知miRNA可能通過作用于哪些靶基因的信號通路而影響骨骼肌的生理過程。

1.8 統(tǒng)計學分析

miRNA差異表達采用Student t檢驗計算P值;GO 分析采用Cytoscape Bingo工具里的超幾何分布方法計算P值，采用多重比較檢驗，確定功能注釋的誤判率（FDR），獲得校正后P值;miRNA通路分析采用mirPath v.3分析工具里的Fisher 精確檢驗計算P值;各分析方法以P<0.05 為顯著性閾值。

2 結(jié)果

2.1 8周有氧運動對骨骼肌miRNAs表達的影響

本研究選取差異表達倍數(shù)的絕對值≥2.0（|Fold Change|≥2.0），為差異表達的miRNAs。若Fold Change>0表示有氧運動上調(diào)的miRNA;若Fold Change<0則為有氧運動下調(diào)的miRNA，結(jié)果如表1。

由表1可知，共發(fā)現(xiàn)58個差異表達的miRNAs，其中上調(diào)表達的miRNAs有44個，下調(diào)表達的miRNAs共有14個。

2.2 miRNA靶基因預測結(jié)果

通過DIANA-microT-CDS和TargetScan軟件分別預測每個差異表達的miRNA的靶基因，兩個預測軟件的結(jié)果取交集，其結(jié)果如表2和表3。

由表2和表3可知，通過DIANA-microT-CDS和TargetScan預測有氧運動上調(diào)、下調(diào)miRNA的靶基因有9 122和3 636個。

2.3 GO分析結(jié)果

采用Cytoscape Bingo 插件對靶基因進行GO功能注釋分析，將得到的分子功能、生物過程和細胞組分注釋結(jié)果，按P值從小到大排列，前5位結(jié)果如表4、表5。

從表4中可以看出，有氧運動上調(diào)miRNA的靶基因，其分子功能主要是與結(jié)合功能相關，如與核酸、蛋白質(zhì)、鋅離子結(jié)合等;靶基因參與的生物過程主要是基因表達和代謝過程的調(diào)控，如基因表達、大分子和初級代謝過程的調(diào)節(jié)等;靶基因編碼的蛋白定位于的細胞組分的不同部位，如細胞內(nèi)、細胞核、細胞器等。

從表5中可以看出，有氧運動下調(diào)miRNA的靶基因的分子功能與結(jié)合功能相關，如與核酸、蛋白質(zhì)以及DNA的結(jié)合等;靶基因參與的生物過程主要是細胞內(nèi)過程、基因表達過程以及核酸代謝過程等;靶基因編碼的蛋白定位于細胞組分的不同部位，如細胞器等。

3.1 8周有氧運動對小鼠骨骼肌miRNA表達的影響

在本研究中，8周的有氧運動引起44個miRNA的表達水平升高，14個miRNA的表達水平降低。運動上調(diào)表達的miRNA中，miR-1的表達水平最高，為對照組的100.92倍。在C2C12細胞中，miR-1可通過靶向組蛋白去乙酰化酶4（HDAC 4）促進肌肉的發(fā)育[2]。肌肉活檢實驗發(fā)現(xiàn)，在人骨骼肌細胞分化的過程中，miR-1的表達水平顯著升高，提示miR-1在人骨骼肌細胞的分化過程中發(fā)揮重要作用[10]。在急性有氧運動干預的實驗中，Safdar等人發(fā)現(xiàn)，急性有氧運動可以上調(diào)小鼠骨骼肌內(nèi)miR-1的表達水平[8]。Nielsen等人研究發(fā)現(xiàn)，人骨骼肌中的miR-1在急性有氧訓練后的表達水平升高，但在12周高強度有氧運動后，miR-1的表達水平下調(diào)[11]。MiR-1是myomiRs中的一種，常見的myomiRs還包括miR-133、miR-206、miR-208以及miR-499等[1]。但本研究中未發(fā)現(xiàn)miR-133、 miR-206 和 miR-208的表達水平顯著變化。除此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)有氧運動可引起小鼠骨骼肌中miR-17、miR-19、miR-27等非myomiRs的差異表達上調(diào)，表明這些miRNA在有氧運動介導的骨骼肌生理過程的調(diào)節(jié)中也起著重要作用。已有文獻報道m(xù)iR-17 、miR-19可調(diào)節(jié)C2C12細胞的增殖分化[12]。MiR-27a可以通過抑制PPARγ基因的表達而抑制骨骼肌的胰島素抵抗[13]，且MiR-27a還與骨骼肌肥大或糖脂代謝調(diào)節(jié)相關[14-15]。

在運動下調(diào)表達的miRNA中，僅有miR-744[16]、miR-486[17]和miR-425-3p[18]有報道與骨骼肌的增殖分化和肌肉肥大相關，它們都屬于非myomiRs。

3.2 差異表達miRNA的靶基因預測及生物功能分析

MiRNA的靶基因預測及生物功能分析表明，無論是上調(diào)的miRNA還是下調(diào)的miRNA，在分子功能上都與大分子（核酸、蛋白質(zhì)）或離子（金屬離子、陽離子）的結(jié)合有關，進而可能會影響轉(zhuǎn)錄活性及激酶活性。已有研究發(fā)現(xiàn)運動可以增加肌細胞增強因子2A基因（MEF2A）與小鼠骨骼肌中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1b基因（Cpt1b）啟動子的結(jié)合[19]，MEF2A是肌生成過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與骨骼肌發(fā)育及再生。而Mef2a（編碼MEF2A蛋白）正是本研究預測差異表達miR-101a-3p、miR-106a-5p、miR-17-5p、miR-190a-5p、miR-20b-5p等的共同靶基因。Cpt1b基因編碼的CPT蛋白是骨骼肌線粒體脂肪酸β-氧化過程中重要的限速酶，提示在有氧運動中引起的這些差異表達的miRNAs可能參與了骨骼肌的能量代謝過程。另外，運動還可以影響MEF2A與葡萄糖轉(zhuǎn)運體（Glut4）的結(jié)合，進而影響葡萄糖的轉(zhuǎn)運[20]。

在運動影響激酶表達的研究中，已發(fā)現(xiàn)有氧運動可上調(diào)蛋白激酶B（PKB/Akt）的mRNA和蛋白表達，進而影響骨骼肌的生理過程[21]。本研究預測結(jié)果顯示，miR-1187、miR-19b-3p、miR-744-5p等均靶向Akt基因，提示這些miRNAs可能參與了運動影響Akt表達的調(diào)控。

3.3 差異表達miRNA的調(diào)控通路分析

從本研究中可以看到，在有氧運動上/下調(diào)miRNA介導的信號通路中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Wnt信號通路是共同的調(diào)節(jié)通路，這也是目前研究相對較多的與骨骼肌生長發(fā)育相關的通路。

MAPK信號通路是細胞內(nèi)的一個蛋白鏈，可將信號傳遞至細胞核DNA，調(diào)控基因表達。MAPK在細胞增殖、分化、凋亡與存活中均發(fā)揮作用[22] 。運動能夠激活MAPK通路，促進通路中的ERK1/2、p38、和JNK表達，被認為是運動對細胞的應激反應[23]。Sylvius等人采用生物信息學方法分析表明，肌營養(yǎng)不良患者骨骼肌中差異表達miRNA（miR-148a、miR-335和miR-136等）可能通過MAPK通路調(diào)節(jié)骨骼肌的修復[24]。然而，目前仍缺乏運動骨骼肌中miRNA對MAPK信號通路調(diào)節(jié)的研究。從本研究中差異表達的miRNA調(diào)控通路分析結(jié)果顯示， miR-340-5p、miR-106a-5p、miR-29a-5p等14個miRNA可通過靶向Mapk、Sos2等基因?qū)趋兰APK信號通路產(chǎn)生影響。有氧運動可能介導miRNA靶向MAPK信號通路，從而引起骨骼肌生理功能改變。運動-miRNA-MAPK通路可能是運動引起骨骼肌重塑的機制之一，但仍需要進一步的實驗驗證。

在目前已有的實驗性研究中，miRNA對Wnt信號通路的調(diào)節(jié)多集中于癌癥研究，如miR-340通過靶向Wnt途徑抑制乳腺癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。miR-199a-5p通過靶向Wnt2信號通路調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖和形態(tài)學改變 [26]。零星的數(shù)據(jù)顯示，miRNA可通過Wnt信號通路發(fā)揮對骨骼肌細胞生長發(fā)育的調(diào)控作用。研究表明，miR-139-5p可通過抑制Wnt信號通路而促進C2C12細胞的生成[27]，但在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)運動引起miR-139-5p的差異表達。另外，在我們的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，有氧運動引起了miR-199a-5p、miR-340-5p、miR-376b-5p、miR-106a-5p等miRNA的差異表達變化，并且發(fā)現(xiàn)這些miRNA均可靶向調(diào)控Wnt通路。

此外，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路也可調(diào)控細胞的代謝、生長、增殖和存活[28]，miRNA與mTOR信號通路的關系是目前研究miRNA的熱點之一。Jia等人研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細胞分化階段miR-199a呈現(xiàn)高表達，進而miR-199a可通過靶向IGF-1、mTOR等基因，發(fā)揮抑制肌細胞分化、促進肌細胞肥大的作用[29]。Wang在采用胍基乙酸誘導的骨骼肌增殖分化模型中發(fā)現(xiàn)，miR-133a-3p和 miR-1a-3p可以通過靶向Akt/mTOR/S6K信號通路促進成肌細胞分化和肌肉生長 [30]。運動通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)表達已被證實[31]，并有研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路參與了運動誘導的骨骼肌肥大[32]，本研究的結(jié)果分析顯示，有氧運動引起的差異表達miRNAs中有miR-340-5p、miR-148b-3p、miR-425-5p 等14個miRNAs可以調(diào)控mTOR信號通路，其中miR-486被實驗驗證可以通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)骨骼肌纖維的大小[17]。然而，運動介導miRNA對mTOR信號通路的調(diào)節(jié)作用機制并不十分清楚。

除上述三個通路外，目前文獻缺乏對本研究中列舉的受差異表達miRNA調(diào)控的其他信號通路與這些miRNA關系的研究報道。揭示運動、miRNA與這些通路之間的關系，還有許多工作要做。

4 結(jié)論

8周有氧運動引起骨骼肌內(nèi)miRNA的差異表達;差異表達miRNA的生物功能涵蓋基因表達調(diào)控、代謝調(diào)控等眾多生物功能;有氧運動引起差異表達miRNAs可能通過靶向MAPK信號通路、Wnt信號通路和mTOR信號通路等調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育和生理生化過程。本研究可為后續(xù)研究有氧運動對骨骼肌生長發(fā)育和生理生化過程的影響機制提供方向。

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