張敬偉 于秀娟 原蕓姿 郭秀珍 董孟華 郝志慧

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 山東 煙臺 264003；2 山東協(xié)和學(xué)院 山東 濟(jì)南 250109

胃癌(gastric cancer，GC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，雖然在治療方面有所進(jìn)展，但其死亡率仍然居惡性腫瘤的第2位[1]。GC的高死亡率緣于發(fā)病的特定生物學(xué)特點(diǎn)，如診斷是否及時(shí)，臨床表現(xiàn)是否延遲以及高侵襲率和轉(zhuǎn)移率等。GC的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此，尋找GC的生物標(biāo)志物或潛在治療靶點(diǎn)對GC的早期確診、治療及預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。

目前，研究者主要在編碼基因中篩選相關(guān)的GC分子標(biāo)記物，然而編碼序列僅占人類基因組的2%。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)不具有編碼DNA的能力[2]。LncRNA通過調(diào)控基因表達(dá)參與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同生命活動(dòng)過程，在腫瘤發(fā)生、侵襲等過程中發(fā)揮重要功能[3]。核富集轉(zhuǎn)錄本(nuclear paraspeckle assembly transcript1，NEAT1)屬于LncRNA，其位于細(xì)胞核內(nèi)，參與構(gòu)成核旁斑的核心結(jié)構(gòu)，并參與眾多基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。它位于人類第11號染色體上一個(gè)被稱為多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病(MEN)1型的基因位點(diǎn)上，由RNA聚合酶2轉(zhuǎn)錄而來，是一種未拼接的、多聚腺苷酸化的，且受核限制的非編碼轉(zhuǎn)錄本[4]。LncRNAs位于特定的核體周圍，即位于亞核體paraspeckles周圍，是維持其結(jié)構(gòu)和功能必不可少的組成部分。Paraspeckles包含數(shù)個(gè)蛋白因子，如SFPQ、P54nrb、pspl、RBN14等，而SFPQ和P54nrb直接與NEAT1結(jié)合，共同參與paraspeckles的形成[5]。

已有研究證實(shí)NEAT1在人類很多惡性腫瘤中異常表達(dá)，包括白血病[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]、卵巢癌[9]和乳腺癌[10]等，并參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等過程。但是在GC中，NEAT1與GC患者的相關(guān)性及在GC中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究通過檢測GC組織及癌旁正常組織中NEAT1的表達(dá)水平，分析NEAT1表達(dá)與GC患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年2月于濟(jì)南市某三甲醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的78例GC患者的GC組織及癌旁(距腫物切除邊緣>5 cm)處正常組織標(biāo)本，所有患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。將手術(shù)切除的GC組織(GC組)及癌旁組織標(biāo)本(正常組)迅速放入液氮中，并置于-80℃超低溫冰箱中保存待測。GC患者中，男46例，女32例，年齡為47～72歲，平均為(55.23±9.20)歲。GC患者臨床病理資料包括年齡、性別、分化程度、有無脈管侵犯、有無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、TNM分期情況以及是否復(fù)發(fā)。臨床分期情況為：Ⅰ期者11例，Ⅱ期者13例，Ⅲ期者22例，Ⅳ期者32例。分化程度為：高分化者21例，中分化者41例，低分化者16例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者28例。浸潤深度為：T1者7例，T2者10例，T3者21例，T4者40例。復(fù)發(fā)者28例，未復(fù)發(fā)者50例。所有參與本研究的患者在實(shí)驗(yàn)前對本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康募斑^程均有充分的了解，患者表示自愿參與本次實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并經(jīng)本院倫理委員會審批通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)為：①受試者經(jīng)病理證實(shí)為GC；②均沒有在術(shù)前進(jìn)行過放療或化療；③所有患者知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①自身免疫性疾病患者；②心力衰竭或呼吸衰竭患者；③合并其他惡性腫瘤患者；④合并心、腎等器質(zhì)性損傷；⑤臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 分離RNA 用TRIzol法分別從GC組織、癌旁正常組織處提取總RNA。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測NEAT1表達(dá)水平 按照Takara試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用qRT-PCR法檢測NEAT1相對表達(dá)量。

1.3 隨訪 術(shù)后采用打電話訪問、門診復(fù)查等方式對患者隨訪，隨訪時(shí)間截止于2018年8月，統(tǒng)計(jì)無病生存期(Disease-free survival，DFS)與總體生存期(overall survival，OS)，并繪制Kaplan-Meier生存曲線，比較GC患者DFS及OS。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用t檢驗(yàn)比較GC組織與癌旁正常組織中NEAT1的表達(dá)，采用χ2檢驗(yàn)分析NEAT1表達(dá)水平與GC患者臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)比較生存率，采用COX單因素與多因素回歸模型分析影響GC患者預(yù)后的相關(guān)因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEAT1在GC中的表達(dá)情況 qRT-PCR結(jié)果顯示，NEAT1在GC組織中的表達(dá)水平高于在癌旁正常胃黏膜上皮組織中的表達(dá)水平，P<0.01，見圖1。

2.2 NEAT1在GC中的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性 按照GC組織中NEAT1的表達(dá)水平(NEAT1表達(dá)的中位數(shù))將GC患者分為NEAT1高表達(dá)組與低表達(dá)組。采用χ2檢驗(yàn)分析NEAT1表達(dá)與患者年齡、性別、分化程度、脈管侵犯、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、臨床分期情況、復(fù)發(fā)等臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，NEAT1表達(dá)與脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)顯著相關(guān)(P<0.05或<0.01)，而與患者年齡、性別、分化程度、有無神經(jīng)侵犯、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性，見表1。

表1 NEAT1表達(dá)水平與GC患者臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

注：*P<0.05，***P<0.001。

2.3 NEAT1表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性 單因素COX回歸分析顯示，NEAT的表達(dá)水平與GC患者的DFS相關(guān)；多因素COX回歸分析顯示，NEAT1表達(dá)水平為患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。單因素COX回歸分析顯示，NEAT1的表達(dá)水平與GC患者的OS相關(guān)；多因素COX回歸分析顯示，NEAT1表達(dá)水平為患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示NEAT1高表達(dá)組的GC患者術(shù)后OS與DFS均少于較NEAT1低表達(dá)組GC患者，P<0.01，見圖2、3。

圖2 NEAT1表達(dá)與患者OS 的Kaplan-Meier生存曲線

圖3 NEAT1表達(dá)與患者DFS的Kaplan-Meier生存曲線

表2 GC患者DFS的單因素與多因素COX回歸分析

注：*P<0.05，**P<0.01。

表3 GC患者OS的單因素與多因素COX回歸分析

注：**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

NEAT1在某些腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常組織，且NEAT1高表達(dá)提示著較差的預(yù)后和更低的五年生存期[6-10]。NEAT1在卵巢癌組織中高表達(dá)，可以成為診斷卵巢癌的重要標(biāo)志物，并且其表達(dá)水平與卵巢癌組織的大小以及腫瘤的分期呈正相關(guān)[11]。此外，NEAT1的表達(dá)與肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(metastasis-assoiated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1)相關(guān)，NEAT1高表達(dá)常伴隨著MALAT1的高表達(dá)，MALAT1是一種通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因剪切發(fā)揮原癌基因作用的LncRNA。NEAT1參與了前列腺癌原癌基因的修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。NEAT1高表達(dá)提示肝細(xì)胞癌患者預(yù)后較差，NEAT1高表達(dá)和患者腫瘤大小、數(shù)目，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，門靜脈癌栓形成和TNM分期相關(guān)[12]。但關(guān)于NEAT1在人GC中異常表達(dá)的報(bào)道較少。

本研究顯示，NEAT1在GC組織中的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，這與嚴(yán)華等[13-14]的研究是一致的。NEAT1表達(dá)與GC脈管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、以及是否復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，而與患者年齡、性別、分化程度、神經(jīng)侵犯、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。這說明NEAT1在GC以及其他惡性腫瘤的發(fā)生中可能起著促癌基因的作用。NEAT1表達(dá)水平為患者DFS與OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。NEAT1高表達(dá)組GC患者的術(shù)后OS與DFS與NEAT1低表達(dá)組GC患者相比均較差。已有關(guān)于NEAT1和肝癌的研究表明，NEAT1高表達(dá)提示肝細(xì)胞癌患者預(yù)后較差。這說明NEAT1高表達(dá)可能影響某些惡性腫瘤患者的預(yù)后。

綜上所述，NEAT1在GC的發(fā)生、發(fā)展過程以及預(yù)后中可能發(fā)揮著一定的作用，可將其作為臨床診斷及評估患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。至于NEAT1在GC的增殖、轉(zhuǎn)移等過程的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探索求證。