丁亮 薛鋒* 肖海軍 沈玉春 趙勇

軟骨終板與椎間盤關(guān)系密切，壓應(yīng)力是引起軟骨終板退變的重要原因。軟骨終板在中心部位、邊緣分別與髓核、纖維環(huán)密切接觸，起緩沖外力和傳遞應(yīng)力的作用[1]。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的、高度保守的、非編碼小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2-4]。研究表明，miRNAs 調(diào)控信號通路及其靶基因表達(dá)與椎間盤退變相關(guān)，miR-21[5]、miRNA-146a[7]可分別通過PTEN/AKT、白細(xì)胞介素-1（IL-1）信號通路調(diào)控髓核細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成[5-7]。但目前研究壓應(yīng)力對軟骨終板miRNA 表達(dá)影響的報道不多。本研究通過miRNA 芯片技術(shù)篩選壓應(yīng)力下人軟骨終板細(xì)胞中差異表達(dá)的 miRNAs，研究與壓應(yīng)力相關(guān)的 miR-22，通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測 miR-22 與 MMP-1 基因的關(guān)系并驗證其對靶基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象及細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

取6 個月意外流產(chǎn)胎兒軟骨終板（已獲南方醫(yī)科大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)），無菌條件下取 L4/5軟骨終板進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，使用含10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8]。Hela 細(xì)胞（由上海諾倫生物公司提供）常規(guī)培養(yǎng)，使用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基（內(nèi)含1.5 mM L-Glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 g/mL Streptomycin）中，置入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及藥品

實驗使用的多聚甲醛、乙二胺四乙酸（EDTA）購自國藥集團(tuán)公司; 總RNA 抽提試劑盒、U6 內(nèi)源性對照試劑盒、PCR 引物設(shè)計合成以及Real-time PCR 擴(kuò)增試劑盒均購自上海諾倫生物公司。miR-22 mimics 的設(shè)計及合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。Trypsin-EDTA 溶液（0.25%Trypsin+0.53 mM EDTA，Hyclone）; Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）。miRCURYTM Array Power Labeling kit、miRCURYTM Array 芯片及Wash buffer kit 均購自Exiqon公司。

1.3 周期性壓應(yīng)力加載

取第2代軟骨終板細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板（密度為1×106/mL），置入37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞90%匯合。為達(dá)到實驗細(xì)胞同步化的目的，使用1%FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后大部分細(xì)胞均處于G0期。將實驗細(xì)胞隨機(jī)分為加壓組與對照組，并通過特定裝置進(jìn)行氣體加壓構(gòu)建細(xì)胞壓應(yīng)力加載模型[8]。該加載裝置的工作原理是將體外培養(yǎng)的軟骨終板細(xì)胞種植在培養(yǎng)皿上，再將培養(yǎng)皿放入密閉壓力倉中，通過供給5%CO2的空氣混合氣，利用氣體產(chǎn)生的靜壓使培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞受到相應(yīng)的壓應(yīng)力作用。加壓組施加周期性壓力（5 MPa，6 h×5 d）; 對照組不施加壓應(yīng)力，僅培養(yǎng)觀察。

1.4 總RNA 的提取

總RNA 的提取使用TRIzol 法，使用RNasey Mini Kit進(jìn)行 RNA 純化，NanoDrop ND-1000 測量純化后的濃度。RNA 的完整性通過瓊脂糖電泳檢查。

1.5 RNA 標(biāo)記與芯片雜交

抽提的 RNA 通過質(zhì)檢后，使用 miRCURYTM Array Power Labeling kit 對miRNA 進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記完成后，將樣品與miRCURYTM LNA Array 芯片雜交，雜交完成后，使用Wash buffer kit 清洗芯片。

1.6 Real-time PCR 分析

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。建立PCR 反應(yīng)體系并進(jìn)行擴(kuò)增（按PCR 試劑盒進(jìn)行）。融解分析產(chǎn)物特異性，并通過電泳鑒定產(chǎn)物正確與否。PCR 引物設(shè)計見表1，軟件分析（Light Cycler Software Version）目的基因相對表達(dá)量。Real-time PCR 反應(yīng)條件:95℃、3 min 變性; 95℃、30 s，62℃、40 s，共 40 個循環(huán)。

表1 各目的基因引物序列

1.7 miR-22 mimics 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

Hela細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%～90%融合時，接種6 孔板。傾去培養(yǎng)液，用2 mL D-Hank's 溶液洗滌細(xì)胞2 次。加入2 mL Trypsin-EDTA 溶液，混勻后，37℃放置5 min。小心吸去胰酶溶液后加入2mL 10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，反復(fù)吹打形成單細(xì)胞懸液。采用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞稀釋至1.5×106細(xì)胞/mL 后接種6 孔板，混勻后于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。miR-22 mimics 用DEPC-H2O溶解至終濃度為20 M。在1.5 mL EP 管中加入250 L Opti-MEM Ⅰ，再分別加入（4 L、8 L、16 L）miR-22 mimics，另取一1.5 mL EP 管，加入250 L Opti-MEM Ⅰ，加入8 L lipofectamin 2000，混勻，室溫放置5 min 后混合兩管試劑，室溫放置20 min。吸去6 孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入1 mL無血清的DMEM 培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入6 孔板中，混勻后，在培養(yǎng)箱中溫育6 h。吸棄轉(zhuǎn)染液，加入1.5 mL 含10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液。37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h，分別收樣。所得細(xì)胞用于RT-PCR 檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差記錄，兩組間比較采用獨立樣本 檢驗，多組間比較采用方差分析，<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片聚類分析結(jié)果

芯片掃描結(jié)果顯示共篩選207 個差異表達(dá)miRNA（部分結(jié)果未顯示），進(jìn)行芯片聚類分析繪制表達(dá)譜圖，圖中紅色越亮，表示基因表達(dá)的水平越高; 綠色越亮，表示基因表達(dá)的水平越低。結(jié)果顯示hsa-miR-22 表達(dá)明顯降低（見圖1）。

2.2 生物信息學(xué)軟件分析

如圖2 所示，TargetScan 預(yù)測分析顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）為 miR-22 的靶基因。

2.3 RT-PCR 檢測壓應(yīng)力下人軟骨終板細(xì)胞miR-22 表達(dá)

RT-PCR 檢測人軟骨終板細(xì)胞加壓組（壓力大小5 Mpa，作用時間6 h×5 d）與正常組（對照組）之間miR-22 表達(dá)情況，U6 作為內(nèi)參照。結(jié)果顯示加壓組miR-22 表達(dá)明顯降低（<0.05）（見圖3）。

圖1 芯片聚類分析顯示miR-22 表達(dá)顯著降低

圖2 TargetScan 預(yù)測miR-22 與MMP-1 3'UTR 結(jié)合位點

圖3 RT-PCR 檢測壓應(yīng)力下人軟骨終板細(xì)胞miR-22 表達(dá)顯著降低（*表示<0.05）

2.4 RT-PCR 檢測壓應(yīng)力下人軟骨終板細(xì)胞miR-22 表達(dá)

miR-22 mimics 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞48 h 后，在同一視野下拍攝細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖片，可見各組細(xì)胞形態(tài)、大小無明顯改變（見圖4）。BLANK 組、NC 組、Mock 組 miR-22 表達(dá)水平接近，mimics 組（M1、M2、M3）miR-22 的表達(dá)出現(xiàn)顯著增高，同時RT-PCR 檢測MMP-1 基因表達(dá)顯著降低（見圖5）。

圖4 miR-22 mimics 轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞圖（×100）（BLANK:空白對照組;NC:mimics 陰性對照組;Mock:轉(zhuǎn)染試劑組;M1:低濃度miR-22 mimics 轉(zhuǎn)染組;M2:中濃度miR-22 mimics 轉(zhuǎn)染;M3:高濃度miR-22 mimics 轉(zhuǎn)染組）

圖5 RT-PCR 檢測miR-22 mimics 轉(zhuǎn)染效果以及MMP-1 基因表達(dá)分析（*表示<0.05）

3 討論

椎間盤退行性病變是臨床常見的病理改變，包括椎間盤纖維環(huán)、髓核以及軟骨終板的退變。盡管椎間盤退變是一種多因素疾病，導(dǎo)致其發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚不十分明確，但隨著對脊柱力學(xué)研究的深入，多項研究表明力學(xué)刺激可直接影響軟骨終板細(xì)胞代謝，影響蛋白合成和蛋白多糖分泌[8-10]，長期壓應(yīng)力作用下會導(dǎo)致軟骨終板細(xì)胞退變[8]。有關(guān)軟骨終板退變是引起椎間盤營養(yǎng)障礙和退變的始動因素的觀點已越來越得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)可，因此探討壓應(yīng)力對軟骨終板細(xì)胞作用的具體分子機(jī)制具有重要意義。

miRNAs 是一類內(nèi)源性的、高度保守的、非編碼小RNA，可以通過靶向mRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，這使它們能夠在細(xì)胞過程中（如增殖、侵襲、凋亡和衰老等）發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究證實，miRNAs 參與了椎間盤退變過程[11-14]，這也為椎間盤退變機(jī)制提供了新的研究思路。Yang 等[11]通過構(gòu)建椎間盤退變（IVDD）的大鼠模型，檢測到miR-143-5p以及靶基因eEF2 異常表達(dá); 同時在體外培養(yǎng)的IVDD 大鼠髓核細(xì)胞（NP）上發(fā)現(xiàn)miR-143-5p 可通過激活A(yù)MPK 信號傳導(dǎo)途徑影響細(xì)胞增殖、凋亡和分化，結(jié)果提示miR-143-5p可作為治療IVDD 的潛在靶點。miR-155 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑和免疫應(yīng)答，其異常表達(dá)與各種疾病相關(guān)，如肺癌、胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等[12-13]。有研究表明[14]，miR-155 在退行性NP細(xì)胞中顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-155 可通過抑制FADD（Fas-associating protein with a novel death domain）和caspase-3 表達(dá)進(jìn)而抑制 NP 細(xì)胞凋亡。此外，先前的研究表明，miR-27a 參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生[15-16]，而 Liu等[17]發(fā)現(xiàn) miR-27a 在退行性 NP 細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，分子機(jī)制研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-27a主要通過直接靶向磷酸肌醇-3 激酶（PI3K）調(diào)控NP 細(xì)胞的凋亡。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是由細(xì)胞分泌的Zn 金屬內(nèi)肽酶的總稱，屬于蛋鋅蛋白酶（metzincin）超家族，能水解細(xì)胞外基質(zhì)組成成分，如膠原蛋白、明膠、層粘連蛋白、聚集蛋白聚糖、纖連蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖等[18-19]。MMP-1屬于 MMPs 中的膠原酶亞家族，其主要作用底物為纖維性膠原，可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維和明膠及改變細(xì)胞的微環(huán)境[19]。多項研究發(fā)現(xiàn) MMP-1 與椎間盤退變程度相關(guān)[19-22]。Deng 等[19]通過酶聯(lián)免疫吸附測定和免疫組織化學(xué)染色分別定量評估了60 名腰椎IVDD 患者術(shù)前靜脈血以及手術(shù)切除椎間盤組織中MMP-1 和TIMP-1 的表達(dá)水平，同時將20 例無椎間盤退變的腰椎損傷患者作為對照，結(jié)果顯示IVDD 患者血清和組織MMP-1 水平顯著高于對照組; 此外亞組分析顯示，與輕度或中度IVDD 患者相比，嚴(yán)重IVDD患者的MMP-1 水平較高。這些結(jié)果表明，在IVDD中MMP-1表達(dá)增加且與癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)。Basaran 等[22]回顧性分析了60 例IVDD 患者，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法評價VAS 評分、腰痛ODI 評分及MRI 影像分級與MMPs 表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者 VAS 評分與 MMP-1、MMP-2、MMP-3 和 MMP-9 密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn) MMP-1 和MMP-2 與增齡相關(guān)。筆者前期亦發(fā)現(xiàn)長期壓應(yīng)力下人軟骨終板細(xì)胞 MMP-1 表達(dá)增高，且其表達(dá)水平與壓應(yīng)力作用時間相關(guān)[8]。本研究通過芯片分析以及 RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，壓應(yīng)力下人軟骨終板細(xì)胞出現(xiàn)miR-22 異常表達(dá); 同時生物信息學(xué)分析進(jìn)一步提示 miR-22與軟骨終板細(xì)胞退變相關(guān)的 MMP-1 基因存在互補(bǔ)配對的序列，且功能試驗結(jié)果顯示，miR-22 mimics 成功轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞后，MMP-1 表達(dá)下降。因此，筆者推測miR-22 參與了壓應(yīng)力致軟骨終板病理過程，其機(jī)制可能與其靶向負(fù)調(diào)控MMP-1 相關(guān)。但miR-22 與靶基因MMP-1 3'UTR 的作用位點仍需雙基因螢光素酶明確，且壓應(yīng)力下 miR-22 的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。