張麗麗,陸佳涵,薛 婧,叢 喆,魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國(guó)家衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

SIV 感染恒河猴后,猴體內(nèi)可產(chǎn)生持續(xù)性感染并形成病毒的儲(chǔ)存庫(kù),與HIV 感染人的過(guò)程極其類似[1]。 清除儲(chǔ)存庫(kù)的策略研究是當(dāng)前艾滋病研究中的熱點(diǎn),因此準(zhǔn)確評(píng)估病毒儲(chǔ)存庫(kù)的大小就顯得非常重要。 目前常用的病毒儲(chǔ)存庫(kù)的定量檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 即qPCR,該方法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中的病毒DNA 拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)相對(duì)意義上的“絕對(duì)定量”[2]。 數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)是近年來(lái)發(fā)展成熟起來(lái)的新技術(shù),相比于qPCR 定量不需要依賴標(biāo)準(zhǔn)品,能直接檢測(cè)出樣品中的拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)定量[3]。

本研究依托 Bio-Rad 公司微滴式 dPCR(ddPCR)技術(shù)平臺(tái),建立了SIV DNA 載量的絕對(duì)定量方法,并對(duì)微滴式dPCR 用于SIV DNA 檢測(cè)的范圍及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估,以期為病毒儲(chǔ)存庫(kù)的定量提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

所用pGEM-SIVgag477 質(zhì)粒,是將SIVmac251病毒RNA gag 基因上1360 ～1837 之間長(zhǎng)度為477 bp 的片段克隆到pGEM T 載體上構(gòu)建而成,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所艾滋病課題組制備并保存[4]。 對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行10 倍系列稀釋,取濃度分別是1、10、102、103、104、105、106、107copies/μL 的8 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行本研究,同時(shí)設(shè)置PCR 水為陰性對(duì)照(Neg)。

1.1.2 樣本

本研究中所用7 份DNA 樣本均是從SIV 感染猴外周血PBMC 中提取,對(duì)應(yīng)編號(hào)依次是S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7。

1.2 主要試劑與儀器

試劑盒為病毒核酸提取使用QIAamp? DNA Mini kit ( QIAGEN, 51306 )； TaqManTMGene Expression Master Mix (Thermo Fisher, 4369016)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR,微滴式dPCR 中用到的ddPCRTMDroplet Reader oil (Bio-Rad, 1863004)、Droplet Generation Oil for Probes ( Bio-Rad,1863005)、ddPCRTMSupermix for Probes(Bio-Rad,1863023)。 引物和探針由invitrogen 公司合成(表1),加水稀釋至10 μmol/L 備用[5]。

表1 微滴式dPCR 檢測(cè)SIV DNA 載量所使用的引物和探針Table 1 Primer and probe sequences for the quantification of SIV DNA detected by droplet dPCR

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微滴式dPCR 實(shí)驗(yàn)

主要實(shí)驗(yàn)步驟如下:首先配制20 μL 定量反應(yīng)體系(混合液10 μL,900 nmol/L 的引物1.8 μL,250 nmol/L 的探針0.5 μL,5.0 μL 的DNA 模板,補(bǔ)充水至20 μL),然后將其加入到DG8 cartridge 中間一排的8 個(gè)孔內(nèi),在最底下一排8 個(gè)孔中各加入70 μL 微滴生成油(DG Oil),蓋上膠墊,開(kāi)始生成微滴。微滴生成于cartridge 最上面一排孔內(nèi),將生成的油滴轉(zhuǎn)移到96 孔板中,封膜后進(jìn)行PCR 反應(yīng),最后用QuantaSoft 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。 微滴式dPCR 反應(yīng)條件:95℃10 min(×1),95℃30 s(×40),60℃1 min(×40),98℃10 min(×1)。

1.3.2 退火溫度的優(yōu)化

本研究中,根據(jù)qPCR 的退火溫度,選擇57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃六個(gè)溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),優(yōu)化ddPCR 的退火溫度。 模板選擇使用104的pGEM-SIVgag477 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,將擴(kuò)增拷貝數(shù)最高的溫度確定為最佳的退火溫度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用 QX200 Droplet Digital System 提供的Quantasoft 軟件進(jìn)行ddPCR 反應(yīng)的圖像處理,graphpad 進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 微滴式dPCR 信號(hào)識(shí)別

本研究中,所有反應(yīng)的微滴生成正常,單個(gè)反應(yīng)的總微滴數(shù)均超過(guò)10000(圖1a),最高是17626,最低是13264,目標(biāo)分子的分布符合泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理[6],保證了后續(xù)分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。 圖1b 中紅色為閾值線,陰性反應(yīng)峰與陽(yáng)性反應(yīng)峰明顯分開(kāi),該方法可準(zhǔn)確檢測(cè)出陰性微滴數(shù)與陽(yáng)性微滴數(shù)。

2.2 微滴式dPCR 反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化

ddPCR 退火溫度在57℃～62℃之間均能檢測(cè)到熒光信號(hào)。 57℃、62℃所得拷貝數(shù)較低,分別為(346±19.23)copies/μL 和(345±3.68)copies/μL,58℃～61℃測(cè)得的拷貝數(shù)比較高且接近,60℃時(shí)拷貝數(shù)最高,為(460±16.97)copies/μL,因此60℃為反應(yīng)最適退火溫度(圖2)。

2.3 10 倍系列稀釋pGEM-SIVgag477 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品微滴式dPCR、qPCR 檢測(cè)結(jié)果及兩種方法的相關(guān)性評(píng)估

pGEM-SIVgag477 質(zhì)粒ddPCR 檢測(cè)的一維散點(diǎn)圖顯示,107copies/μL 標(biāo)準(zhǔn)品為全陽(yáng)性微滴,無(wú)陰性微滴(圖3a),超出了檢測(cè)上限；從10 ～106copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品,ddPCR 的檢測(cè)值在0.3 ～3.96 × 104copies/μL 時(shí),qPCR 與ddPCR 測(cè)定結(jié)果線性關(guān)系良好,r=0.9981,提示該檢測(cè)方法可靠。 1copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品用qPCR 方法未檢出(見(jiàn)圖3b),ddPCR 方法也大部分顯示陰性,雖然個(gè)別孔檢測(cè)出數(shù)值,但明顯偏離線性曲線,因此也判定為陰性(見(jiàn)表2)。

圖1 總微滴數(shù)生成柱狀圖及檢測(cè)結(jié)果直方圖Note. a, histogram of total droplet number for pGEM-SIVgag477.b, histogram of test results for different concentrations.Figure 1 Histogram of total droplet number and histogram of test results

2.4 樣本檢測(cè)

分別使用ddPCR 及qPCR 兩種方法檢測(cè)了7份SIV 感染猴PBMC 的DNA 樣本。 ddPCR 檢測(cè)樣本的CV 值介于1.34%～16.13%之間,隨著拷貝數(shù)減少變異系數(shù)逐漸增大。 但(1.7±0.14)copies/μL以上的樣本檢測(cè)變異系數(shù)均低于10%,顯示了良好的穩(wěn)定性。 S6、S7 的檢測(cè)結(jié)果均小于1copies/μL,CV 值均大于15%(見(jiàn)表3)。

3 討論

艾滋病毒感染機(jī)體后形成的病毒儲(chǔ)存庫(kù),是目前艾滋病治療中的最大障礙。 如何準(zhǔn)確評(píng)估病毒儲(chǔ)存庫(kù)的大小就顯得尤為迫切。 第三代PCR 技術(shù)——數(shù)字PCR 自問(wèn)世以來(lái),就被寄予厚望。 不同于現(xiàn)階段被廣泛應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù),它能夠直接計(jì)算出待檢樣本的拷貝數(shù),不依賴Ct 值及標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)現(xiàn)了真正意義上的絕對(duì)定量。 尤其近年來(lái)在突破了樣品分配的瓶頸后,其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,包括拷貝數(shù)變異分析[7]、復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè)[8]以及病毒拷貝數(shù)檢測(cè)[9]等。 本研究中,我們嘗試建立了微滴式dPCR 方法,用于定量檢測(cè)SIV DNA 拷貝數(shù)。 結(jié)果顯示在0.3 copies/μL 到3.96 × 104copies/μL 的范圍內(nèi),能夠?qū)崿F(xiàn)有效擴(kuò)增,線性關(guān)系良好。 與qPCR 相比,靈敏度基本保持一致。 但隨著樣本拷貝數(shù)的降低,微滴式dPCR 檢測(cè)結(jié)果變異度也還是明顯加大,檢測(cè)結(jié)果不太穩(wěn)定。 如果樣本拷貝數(shù)超出檢測(cè)上限,也不能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增,需要對(duì)其進(jìn)行稀釋后再檢測(cè)。ddPCR 的檢測(cè)范圍過(guò)窄,可能和該技術(shù)需要對(duì)樣本進(jìn)行極限稀釋有關(guān)。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn),現(xiàn)階段微滴式dPCR 實(shí)驗(yàn)過(guò)程稍顯繁瑣,對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高。 例如整個(gè)操作過(guò)程需要多次轉(zhuǎn)板易造成樣本的損失；加樣產(chǎn)生微小氣泡妨礙油滴生成,繼而導(dǎo)致PCR 無(wú)法正常擴(kuò)增。 這些操作可能限制了該技術(shù)的普及和大規(guī)模使用。 但作為一項(xiàng)新興技術(shù),微滴式dPCR還是給艾滋病研究帶來(lái)了很大的驚喜,對(duì)艾滋病毒儲(chǔ)存庫(kù)更真實(shí)準(zhǔn)確地定量檢測(cè),將對(duì)清除儲(chǔ)存庫(kù)策略研究、抗艾滋病疫苗及藥物研究提供有效的技術(shù)保障。

圖2 ddPCR 不同退火溫度下測(cè)定pGEM-SIVgag477質(zhì)粒的拷貝數(shù)結(jié)果Figure 2 Copy numbers of pGEM-SIVgag477 detected by ddPCR at different annealing temperatures

表2 10 倍系列稀釋pGEM-SIVgag477 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品qPCR 及ddPCR 檢測(cè)結(jié)果Table 2 10-fold serial dilution output of pGEM-SIVgag477 detected by ddPCR and qPCR

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增一維散點(diǎn)圖及不同檢測(cè)方法相關(guān)性評(píng)估Note: a, One-dimensional scatter plot of pGEM-SIVgag477 detected by ddPCR. b, liner correlation analysis of ddPCR and qPCR.Figure 3 One-dimensional scatter plot and liner correlation analysis

表3 ddPCR 及qPCR 測(cè)定SIV 感染猴PBMC 中total DNA 拷貝數(shù)結(jié)果Table 3 The results of DNA samples detected by ddPCR and qPCR separately