向文碧,李志操,周棟珍,周艷華,吳西軍,何志旭,舒莉萍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,兒科學(xué)教研室,貴陽(yáng) 550004； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550004； 3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科學(xué)教研室,貴州 遵義 563000； 4.貴州省貴陽(yáng)市婦幼保健院/貴陽(yáng)市兒童醫(yī)院,貴陽(yáng) 550003；5.貴州大學(xué),貴陽(yáng) 550025)

目前,惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率仍逐年上升,是威脅人類生命安全的主要疾病之一。 惡性腫瘤主要的治療措施包括化療、放療及手術(shù)切除等,但是多數(shù)腫瘤的治療效果仍不令人滿意,其主要原因是化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了多藥耐藥導(dǎo)致化療效果不佳。 多藥耐藥是指最初對(duì)單一抗癌藥物產(chǎn)生耐藥的癌細(xì)胞后來(lái)對(duì)結(jié)構(gòu)或功能不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉、廣譜耐藥性的現(xiàn)象[1]。 多藥耐藥的主要機(jī)制是ATP 結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)利用ATP 水解釋放能量將抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外[2]。 ABCB1(即MDR1)編碼的P 糖蛋白(p-glycoprotein, P-gp)是ABC 家族的主要成員之一,是引起腫瘤多藥耐藥的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是研究熱點(diǎn)之一[3]。

近年來(lái),斑馬魚(yú)作為一個(gè)新型的模式生物在高通量藥物篩選研究方面擁有其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所不具備的天然優(yōu)勢(shì)[4]。 斑馬魚(yú)abcb4 基因與人類ABCB1基因的氨基酸序列相似度高達(dá)64%[5],且斑馬魚(yú)abcb4 基因與藥物在體內(nèi)的吸收與積累量有關(guān)[6]。漢防己甲素(Tetrandrine,TET)是中國(guó)傳統(tǒng)的硅肺、自身免疫性疾病、炎癥性肺病、心血管疾病和高血壓的臨床藥物。 大量研究證明,TET 抑瘤作用不明顯,但是與化療藥物組合能通過(guò)抑制P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體逆轉(zhuǎn)化療藥物產(chǎn)生的耐藥性,從而增強(qiáng)化療藥物的腫瘤抑制作用[7-9]。 但是漢防己甲素在斑馬魚(yú)體內(nèi)的毒性研究及其對(duì)斑馬魚(yú)耐藥基因abcb4 表達(dá)的影響,未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 因此,本研究通過(guò)研究TET 對(duì)Tubingen 野生型斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育的毒性作用及TET 與化療藥物長(zhǎng)春堿(vinblastine, VLB)和阿霉素(doxorubicin,DOX)聯(lián)合對(duì)多藥耐藥基因abcb4 表達(dá)及功能的影響,以期探討漢防己甲素在斑馬魚(yú)體內(nèi)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Tubingen 野生型斑馬魚(yú)為本實(shí)驗(yàn)中心自行傳代培育[SYXK(黔)2018-0001],采用0～5 d 的斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú),按照3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

TET 和VLB 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；DOX 購(gòu)自大連美輪；TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自芬蘭Thermo 公司；IQTMSYBR Green Supermix 試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚(yú)養(yǎng)殖方法

Tubingen 野生型斑馬魚(yú)養(yǎng)殖于(28±5)℃的循環(huán)水系統(tǒng)中,光照/黑暗時(shí)間比為12/12 h[10]。 3 個(gè)月左右斑馬魚(yú)發(fā)育成熟后進(jìn)行交配,交配時(shí)將雄魚(yú)和雌魚(yú)按比例為1 ∶1或2 ∶1放入缸中,用隔板分隔開(kāi),次日光照10 min 后拔板,半小時(shí)后收集胚胎并清洗雜質(zhì),加入胚胎培養(yǎng)液eggwater(0.06 mg/mL海鹽、亞甲基藍(lán))放置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每8 h 更換一次新的eggwater,吸出死胚。 幼魚(yú)5 ～7 d左右以草履蟲(chóng)喂養(yǎng),12～15 d 以后以豐年蟲(chóng)喂養(yǎng)。

1.3.2 毒性實(shí)驗(yàn)

將TET 用eggwater 配制成濃度分別為0、2.5、5、10、20、40 μmol/L 的藥液,挑選受精后12 h(12 hours post-fertilization,12 hpf)且發(fā)育時(shí)相一致的斑馬魚(yú)胚胎,每組100 枚5 mL 藥液于6 孔板內(nèi)進(jìn)行藥物暴露,將6 孔板放入鋁盒中置于生化培養(yǎng)箱中28℃避光培育。 每天更換藥液3 次并定時(shí)去除死亡的胚胎及幼魚(yú),觀察并統(tǒng)計(jì)胚胎或幼魚(yú)在不同時(shí)相的死亡、孵化、心率和畸形情況。 通過(guò)Excel 軟件采用概率單位法計(jì)算TET 在斑馬魚(yú)上的LC50。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)處理分組

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6 個(gè)處理組,每組選取100 枚發(fā)育正常并且時(shí)相一致的的Tubingen 野生型斑馬魚(yú)胚胎。 對(duì)照(control, CT)組:不加藥液用等體積eggwater 處理；DOX 組:以終濃度為10 μmol/L 的DOX 藥液進(jìn)行處理[5]；VLB 組:以終濃度為3.08 μmol/L 的VLB 藥液進(jìn)行處理[11]；TET 組:用20 μmol/L 的TET 藥液處理；TET 聯(lián)合DOX 組:以含有20 μmol/L TET 和10 μmol/L DOX 的混合藥液進(jìn)行處理。 TET 聯(lián)合VLB 組:以含有20 μmol/L TET 和3.08 μmol/L VLB 的混合藥液進(jìn)行處理。 每個(gè)組挑選12 hpf 的胚胎開(kāi)始藥物處理。 每8 h 更換1 次藥液,直至120 hpf。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集各組120 hpf 藥物處理后的野生型斑馬魚(yú)幼魚(yú)于1.5 mL Ep 管中(50 尾/管),每管均加入0.2 mL TRIzol 液后用黃槍頭充分吹打制成勻漿。 按TRIzol 法提取總RNA,最后用DEPC 水溶解RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 根據(jù)斑馬魚(yú)abcb4 基因的mRNA序列(JQ014001,NCBI),設(shè)計(jì)abcb4 基因引物,F:5 ’-GTTGCTGTATTCTCCTATCG-3 ’, 5 ’-R:ATCTCCAGTCTCG TTCCA-3’,送上海捷瑞公司合成。 根據(jù)IQTMSYBR Green Supermix 試劑的反應(yīng)體系按擴(kuò)增條件:95℃,10 min；95℃,15 s；55℃,20 s；72℃,20 s；40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,并采用2-△△Ct值分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 羅丹明123 染色

用eggwater 將羅丹明123 配制成5 mol/L 的染液。 收集各組120 hpf 藥物處理后的野生型斑馬魚(yú)幼魚(yú)于6 孔板中,每孔50 尾,用eggwater 將幼魚(yú)清洗3 次吸干水分后,每組加入5 mL 羅丹明藥液,28.5℃下避光培養(yǎng)2 h。 通過(guò)檢測(cè)羅丹明123 染料在斑馬魚(yú)體力的累積量變化情況檢測(cè)斑馬魚(yú)的藥物外排功能,從而檢測(cè)斑馬魚(yú)的耐藥程度變化[12]。

1.3.6 酶標(biāo)儀檢測(cè)幼魚(yú)熒光強(qiáng)度

收集各組經(jīng)藥物處理和羅丹明123 染色后的野生型斑馬魚(yú)幼魚(yú),50 尾/組,用1×PBS 洗滌3 次后再加入350 μL 的1×PBS,用研磨棒研磨胚胎直至在顯微鏡下看不到明顯組織塊后,2643 r/min 離心5 min,吸取上清液用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定羅丹明123 熒光強(qiáng)度值:激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm 和528 nm,每組均設(shè)置3 個(gè)平行樣。

1.3.7 斑馬魚(yú)熒光強(qiáng)度觀察

收集各組經(jīng)藥物處理和羅丹明123 染色后的野生型斑馬魚(yú)幼魚(yú)。 用eggwater 反復(fù)洗滌幼魚(yú)3 次后,將其置于共聚焦皿中,加入適量30 g/L 甲基纖維素進(jìn)行固定,用活細(xì)胞工作站進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次或3 次以上, 采用GraphPadPrism 5 軟件的單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 TET 暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)

當(dāng)藥物濃度低于10 μmol/L 時(shí),胚胎死亡率較低(圖1),對(duì)照組、2.5 μmol/L 組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的死亡率相差不大。 5 μmol/L 組、10 μmol/L 組、20 μmol/L組和40 μmol/L 組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的死亡率緩慢上升,40 μmol/L 組胚胎死亡率從48 hpf 開(kāi)始迅速升高,至120 hpf,40 μmol/L 組死亡率達(dá)到90%。 說(shuō)明TET 對(duì)于胚胎的發(fā)育毒性較低,但高劑量的TET 對(duì)胚胎仍有致死性。 根據(jù)胚胎各時(shí)間點(diǎn)的死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到TET 的半數(shù)致死濃度LC50=22.12 μmol/L。

2.2 TET 暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響

圖1 暴露于不同濃度TET 的斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)死亡率Figure 1 Mortality rate in zebrafish embryos and larvae exposed to different concentrations of Tetrandrine

48 hpf 時(shí),與對(duì)照組相比,2.5 μmol/L 組和5 μmol/L組孵化率無(wú)明顯變化,當(dāng)藥物濃度大于10 μmol/L時(shí)隨著藥物暴露濃度的增加孵化率逐漸下降(P＜0.01)；72 hpf 時(shí),2.5 μmol/L 組與對(duì)照組相比孵化率無(wú)明顯變化,當(dāng)藥物濃度大于5 μmol/L時(shí)孵化率逐漸下降(P ＜0.001),當(dāng)藥物濃度為40 μmol/L 時(shí)孵化率僅為33.7%(圖2)。

2.3 TET 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心率的影響

藥物對(duì)斑馬魚(yú)心臟功能的影響也是評(píng)價(jià)藥物毒性的一個(gè)重要指標(biāo),斑馬魚(yú)心跳在20 hpf 左右開(kāi)始出現(xiàn),心臟大約在48 hpf 左右即可發(fā)育完全。 但藥物對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育可能存在抑制作用,故選擇72 hpf 觀察斑馬魚(yú)幼魚(yú)的心臟跳動(dòng),統(tǒng)計(jì)在不同濃度下斑馬魚(yú)的心率。 結(jié)果顯示72 hpf 時(shí)斑馬魚(yú)的心率在130 ～140 次/分,2.5 μmol/L 組與對(duì)照組相比心率變化不明顯,當(dāng)藥物濃度增加到5 μmol/L 以上時(shí),隨著藥物濃度的增加,斑馬魚(yú)的心率呈下降趨勢(shì)(如圖3 所示,P＜0.001),說(shuō)明高藥物濃度會(huì)降低斑馬魚(yú)的心率,影響斑馬魚(yú)的心臟功能。

2.4 TET 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎畸形率的影響

與對(duì)照組相比,斑馬魚(yú)幼魚(yú)的畸形率隨著藥物濃度的增加呈明顯的上升趨勢(shì)(P ＜0. 001),表明TET 暴露對(duì)斑馬魚(yú)有發(fā)育毒性作用,當(dāng)藥物濃 度 為40 μmol/L 時(shí), 幼 魚(yú) 的 畸 形 率 高 達(dá)82. 7%,見(jiàn)圖4。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

不同藥物處理組的斑馬魚(yú)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示,與對(duì)照組相比,DOX 和VLB 單獨(dú)處理組abcb4 基因的mRNA 表達(dá)增加(P＜0.05)。 TET 和DOX 共同處理組及TET 和VLB 共同處理組相比于DOX 和VLB 單獨(dú)處理組abcb4 基因的mRNA 表達(dá)降低(P＜0.01)。

圖2 暴露于不同濃度TET 的斑馬魚(yú)胚胎孵化率Note. Compared with the 0 μmol/L group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 2 Embryo hatching rate of zebrafish exposed to different concentrations of Tetrandrine

圖3 暴露于不同濃度TET 的斑馬魚(yú)胚胎心率Note. Compared with the 0 μmol/L group,***P＜0.001.Figure 3 Heart rate of zebrafish embryos exposed to different concentrations of Tetrandrine

圖4 暴露于不同濃度TET 的斑馬魚(yú)幼魚(yú)畸形率Note. Compared with the 0 μmol/L group,***P ＜0.001.Figure 4 Malformation rate of zebrafish larva exposed to different concentrations of Tetrandrine

2.6 野生型斑馬魚(yú)的耐藥程度檢測(cè)結(jié)果

不同藥物處理組的野生型斑馬魚(yú)羅丹明123 染色后經(jīng)活細(xì)胞工作站拍攝(圖6A)和酶標(biāo)儀檢測(cè)(圖6B)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,DOX 和VLB 單獨(dú)處理組熒光強(qiáng)度減弱,耐藥程度增加(P＜0.001)。TET 和DOX 共同處理組及TET 和VLB 共同處理組相比于DOX 和VLB 單獨(dú)處理組熒光強(qiáng)度增強(qiáng),耐藥程度顯著下降(P＜0.001)。

圖5 不同藥物處理后斑馬魚(yú)胚胎abcb4基因的mRNA 表達(dá)變化Note. The DOX and VLB groups compared with the CT group,*P ＜0.05. The TET+DOX group compared with the DOX group,**P ＜0.01.The TET+VLB group compared with the VLB group,***P ＜0.001.Figure 5 Relative abcb4 mRNA expression of drug-treated wild type zebrafish

3 討論

目前化療仍是腫瘤治療的重要措施之一,化療過(guò)程中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體過(guò)度表達(dá)使藥物外排增加引起的多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因,而在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體中導(dǎo)致多藥耐藥的首要因素是ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的過(guò)度表達(dá)[1,13]。 近年來(lái),斑馬魚(yú)作為一個(gè)新型的模式生物在高通量藥物篩選研究方面擁有其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所不具備的天然優(yōu)勢(shì),且斑馬魚(yú)體內(nèi)的abcb4 基因與人類ABCB1 基因的氨基酸序列高度相似。 因此,本課題基于斑馬魚(yú)的優(yōu)勢(shì)選擇斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究。

TET 是一種于植物粉防己的塊根中提取的雙芐基異喹啉類生物堿[14]。 早期因其具有消炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗纖維化等功效而被廣泛應(yīng)用于臨床治療高血壓、矽肺、肝纖維化等疾病,取得非常好的療效[15]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),TET 是一種有效的抑制劑,可逆轉(zhuǎn)由P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的多藥耐藥,在抗腫瘤治療及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥方面有良好的應(yīng)用前景[16]。

本研究利用斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行TET 濃度梯度暴露后,毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只有高濃度的TET 有明顯致畸致死效應(yīng),而用中低濃度的TET 藥液處理胚胎致畸致死效應(yīng)不明顯。 通過(guò)對(duì)死亡率的統(tǒng)計(jì)分析得出TET 在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期的LC50=22.12 μmol/L。根據(jù)該藥物濃度選用20 μmol/L 對(duì)野生型斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行藥物暴露,并收集胚胎進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 不同藥物處理后經(jīng)羅丹明123 染色后的野生型斑馬魚(yú)耐藥程度Note. A, Photograph of live cell imaging system. B, Detection of fluorescent expression of EGFP. The DOX and VLB groups compared with the CT group, the TET+DOX group compared with the DOX group,the TET+VLB group compared with the VLB group,***P ＜0.001.Figure 6 Drug resistance in drug-treated wild type zebrafish stained with Rhodamine 123

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)abcb4 耐藥基因的mRNA 表達(dá)變化,從而判斷所用藥物是否產(chǎn)生針對(duì)abcb4 的耐藥。 結(jié)果顯示,通過(guò)用DOX 和VLB 藥液?jiǎn)为?dú)處理后,斑馬魚(yú)abcb4 耐藥基因的mRNA 表達(dá)增高,說(shuō)明斑馬魚(yú)體內(nèi)的耐藥基因abcb4 被激活使斑馬魚(yú)產(chǎn)生了耐藥,這與之前報(bào)道的DOX 和VLB藥物能產(chǎn)生針對(duì)于ABCB1 耐藥的結(jié)果一致[17-19]。此外,還發(fā)現(xiàn)TET 聯(lián)合DOX 及TET 聯(lián)合VLB 共同處理時(shí)比DOX 和VLB 單獨(dú)處理時(shí)斑馬魚(yú)abcb4 耐藥基因的mRNA 表達(dá)降低,提示TET 能逆轉(zhuǎn)DOX和VLB 引起的耐藥,這與之前報(bào)道的體外試驗(yàn)中TET 可逆轉(zhuǎn)P-gp 介導(dǎo)的多藥耐藥性結(jié)果一致[8,16,20]。 為進(jìn)一步驗(yàn)證TET 在斑馬魚(yú)體內(nèi)能逆轉(zhuǎn)化療藥物DOX 和VLB 引起的耐藥,本研究采用羅丹明123 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同藥物處理后斑馬魚(yú)的藥物外排功能變化,進(jìn)一步檢測(cè)不同藥物處理組的野生型斑馬魚(yú)的耐藥程度變化情況。

羅丹明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)DOX 和VLB 處理后斑馬魚(yú)體內(nèi)羅丹明染液累積量降低,說(shuō)明斑馬魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)abcb4 的耐藥,DOX 和VLB 藥物暴露后,abcb4 編碼的P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)體激活將羅丹明染液排出體外從而導(dǎo)致斑馬魚(yú)體內(nèi)羅丹明染液累積量降低,與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)到的結(jié)果一致。 此外,TET 聯(lián)合DOX 及TET 聯(lián)合VLB 共同處理時(shí)比DOX 和VLB單獨(dú)處理時(shí)斑馬魚(yú)體內(nèi)羅丹明123 染液累積量增加,提示TET 能逆轉(zhuǎn)DOX 和VLB 引起的耐藥,這與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果一致。 此外,TET 聯(lián)合DOX共同處理比TET 單獨(dú)處理時(shí)斑馬魚(yú)體內(nèi)羅丹明123染液累積量增加,而abcb4 耐藥基因的mRNA 表達(dá)量無(wú)明顯差異,提示TET 聯(lián)合DOX 時(shí)TET 可能通過(guò)下調(diào)abcb4 的表達(dá)量和降低abcb4 轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性兩種方式逆轉(zhuǎn)DOX 引起的耐藥。

綜上所述,本研究首先證實(shí)了TET 對(duì)斑馬魚(yú)具有較低的發(fā)育毒性；其次,證實(shí)斑馬魚(yú)體內(nèi)的abcb4基因相關(guān)耐藥機(jī)制與人體內(nèi)ABCB1 基因相關(guān)耐藥機(jī)制高度保守。 最后確定TET 對(duì)易引起腫瘤耐藥的DOX 和VLB 有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用,為T(mén)ET 的臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也證實(shí)了斑馬魚(yú)在藥物篩選方面的可行性。