廉 虹,劉立會(huì),聶 宇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,國(guó)家心血管病中心,阜外醫(yī)院,心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100037)

酒精性心肌病是一類(lèi)由于長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致的心肌病,是臨床上常見(jiàn)的引起心力衰竭的原因,主要特征表現(xiàn)為左心室質(zhì)量增加、心室擴(kuò)張、室壁變薄和心室功能不全或伴有不同類(lèi)型的心律失常[1]。 其具有發(fā)病率高,預(yù)后差的特點(diǎn),早期不易發(fā)現(xiàn),容易被誤診,晚期易出現(xiàn)心力衰竭,有些患者最終走向必須進(jìn)行心臟移植的地步[2-3]。 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,人民生活水平不斷提高,飲酒已不再是一種奢侈行為,導(dǎo)致酒精性心肌病發(fā)病率逐年上升。

酒精性心肌病臨床表現(xiàn)類(lèi)似擴(kuò)張型心肌病,并且目前尚無(wú)特異性的組織病理、生化標(biāo)志物作為病理學(xué)方面判斷酒精性心肌病的依據(jù),所以區(qū)分酒精性心肌病和擴(kuò)張型心肌病,一直是臨床上的難題[4-6]。 目前而言,酒精性心肌病的診斷只能通過(guò)患者的過(guò)量長(zhǎng)期的飲酒史將其從擴(kuò)張型心肌病中區(qū)分出來(lái)[7]。 雖然這兩種心肌病的臨床表型非常相似,但是造成同樣結(jié)局的機(jī)制理論上來(lái)說(shuō)是完全不同:擴(kuò)張型心肌病主要的原因是遺傳導(dǎo)致的[8-9],而酒精性心肌病發(fā)病原因很顯然不屬于經(jīng)典遺傳學(xué)范疇。 因此,用于研究擴(kuò)張型心肌病機(jī)制的動(dòng)物模型,雖然與酒精性心肌病具有相同的表型特征,但是不能用于酒精性心肌病的病理機(jī)制研究的。所以,為了揭示酒精性心肌病的發(fā)病機(jī)制以及得到更好的預(yù)后和治療方法,構(gòu)建良好的酒精性心肌病模型是十分必要的。

本研究通過(guò)添加了乙醇的成分明確、能量平衡的液體飼料長(zhǎng)期喂食,成功構(gòu)建了酒精性心肌病小鼠模型,為酒精性心肌病的機(jī)制研究提供了良好動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡SPF 級(jí)別C57BL/6 小鼠30 只購(gòu)買(mǎi)于維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],全部為雄鼠,飼養(yǎng)至16 周(體重27～32 g)進(jìn)行液體飼料喂養(yǎng)。 小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室小動(dòng)物平臺(tái)屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(京)2017-0015],飼養(yǎng)間溫度(23±2)℃,12 h/12 h 明暗交替照明。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及的動(dòng)物所有操作程序符合3R 原則,已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào):FW-2017-0004。

1.2 主要試劑與儀器

液體飼料成分(Lieber-DeCarli)購(gòu)自創(chuàng)亞化工(上海)有限公司,產(chǎn)自德國(guó)Bio Serv 公司(貨號(hào):F1697SP)；麥芽糖糊精(貨號(hào):3585),液體飼料喂養(yǎng)瓶(貨號(hào):9019),喂養(yǎng)瓶固定器(貨號(hào):9015),95%乙醇購(gòu)于北京化工廠；4% 多聚甲醛溶液購(gòu)于北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；小鼠心臟超聲儀(Vevo 2100)；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica 公司；圖像拍攝顯微鏡(Leica TCS NT)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液體飼料的配制

由于飼料配制過(guò)程中涉及到一些重要的細(xì)節(jié)問(wèn)題,所以以制備1 L 飼料(乙醇濃度4.8%)為例描述流體飼料的配制,配制過(guò)程如下:(1)稱(chēng)量130 g 的飼料粉和5 g 麥芽糖糊精；(2)將三分之一稱(chēng)量好的固體粉末倒入一個(gè)2.5 L 的玻璃瓶中,加入890 mL 溫?zé)岬淖詠?lái)水(非蒸餾水),劇烈振搖后,磁力攪拌器攪拌5 min；(3)待溶解均勻后,再加入三分之一固體粉末,繼續(xù)攪拌約5 min；(4)重復(fù)步驟(3),直至全部固體粉末溶解均勻,加入63.6 mL 的95%乙醇,充分混合后待喂食。 同理配制對(duì)照飼料,由于不添加乙醇,所以缺失的能量用麥芽糖糊精補(bǔ)充,以平衡乙醇組中乙醇的卡路里。 固體粉末溶解過(guò)程同前所述,切記不可將固體粉末一次性全部溶解,由于固體飼料粘度很高,一次性倒入很難溶解。制備好的飼料應(yīng)該冰箱保存,宜在3 d 內(nèi)使用,防止飼料變質(zhì)。

液體飼料喂養(yǎng)瓶添加飼料方法:用拇指堵住喂養(yǎng)孔,從上方填充液體飼料30 mL,并旋緊螺帽。 顛倒喂養(yǎng)管排除滯留的氣泡,將其放置在鼠籠的喂養(yǎng)管固定器上(圖1A)。 由于液體飼料極易變質(zhì),需要每天進(jìn)行飼料更換和飼養(yǎng)瓶的清洗、高壓,所以飼養(yǎng)瓶最好準(zhǔn)備兩套,可輪換使用。

1.3.2 小鼠模型的建立

本研究采用乙醇量逐步增加的方式進(jìn)行酒精性心肌病模型的構(gòu)建[10]。 16 周齡的雄性小鼠每籠三只,其中對(duì)照組(WT 組)9 只,乙醇組(WT+Alc組)21 只,進(jìn)行乙醇飼料或等熱量麥芽糖糊精對(duì)照飼料喂養(yǎng)(表1),共喂養(yǎng)8 周,每?jī)芍苌咭淮我掖己?%,w/v),具體為:第1、2 周是4.8%,第3、4周是5.0%,第5、6 周是5.2%,第7、8 周升高至5.4%(圖1B)。 每三天配制一次液體飼料,冰箱冷藏,每天進(jìn)行飼料的添加,添加量與前1 d 小鼠的食量相當(dāng)。 每周進(jìn)行一次體重的測(cè)量,同時(shí)記錄飼養(yǎng)過(guò)程中死亡小鼠個(gè)數(shù)。 喂養(yǎng)8 周后,對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),檢測(cè)結(jié)束進(jìn)行安樂(lè)死后,取心臟組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)(圖1B)。

1.3.3 心臟超聲檢查

流體飼料喂養(yǎng)8 周后,采用異氟烷氣體麻醉的方式進(jìn)行小鼠麻醉,脫去心前區(qū)的被毛,利用小動(dòng)物心臟超聲儀(探頭型號(hào):550)。 記錄左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall,LVAW)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall,LVPW)、左心室內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at endsystole,LVID)等參數(shù),射血分?jǐn)?shù)(percent ejection fraction,EF%), 短軸縮短率( percent fractional shortening,FS%)由計(jì)算得出。

1.3.4 小鼠心臟組織標(biāo)本的獲取和HE 染色

液體飼料喂養(yǎng)8 周后,行頸椎脫臼法進(jìn)行安樂(lè)死,采用眼科剪打開(kāi)胸腔,摘取心臟。 PBS 沖洗后用擦手紙吸拭心臟表面液體,稱(chēng)重后立即浸入4%多聚甲醛液體中進(jìn)行固定,將固定管置于搖床上進(jìn)行搖晃,使固定液充分浸入組織,固定48 h 后,流水沖洗30 min,組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋。 利用切片機(jī)將包埋好的蠟塊按縱切面切片,厚度4 μm,展臺(tái)展開(kāi)后用病理片撈起,常溫晾干備用。

備用的切片68℃烘烤45 min 后,梯度乙醇脫蠟后,水沖洗1 min,蘇木精染液染色5 min 后水沖1 min,1% 鹽酸乙醇分化2 s,自來(lái)水沖洗泛藍(lán),0.5%的伊紅染液浸入2 min,水沖洗后放置70%乙醇中,然后梯度乙醇脫水,樹(shù)脂封片,晾干后鏡下觀察,Leica 顯微鏡拍攝圖片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用student’t 檢驗(yàn),P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重和生存率分析

在液體飼料喂養(yǎng)的8 周過(guò)程中,每天進(jìn)行液體飼料的更換,3 d 配制一次飼料,每周進(jìn)行一次體重的測(cè)量,同時(shí)記錄小鼠的死亡情況。 對(duì)照組(WT,n=9)和乙醇喂養(yǎng)組(WT+Alc,n=21)兩組小鼠,液體飼料喂養(yǎng)8 周后,兩組小鼠體重均有增長(zhǎng),WT 組小鼠體重增長(zhǎng)17.3%,WT+Alc 組增加8.2%,WT 組較WT+Alc 組增長(zhǎng)明顯。 在接受液體飼料喂養(yǎng)前,WT組和WT+Alc 組體重?zé)o顯著差異(WT:(31.3±1.0)；WT+Alc:(30.5 ± 2.1),P=0.347),喂養(yǎng)一周后,WT+Alc 組小鼠較WT 組體重開(kāi)始降低,并且差異具有顯著學(xué)差異(WT:(31.6 ±1.2)；WT+Alc:(29.9 ±1.2),P=0.048),直至第八周,WT+Alc 組小鼠體重較對(duì)照組降低9.8%(WT:(36.7 ±2.5)；WT+Alc:(33±2.6),P=0.003)(圖2A)。 在喂養(yǎng)過(guò)程中,WT 組小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,生存率100%；WT+Alc 組小鼠在不同的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,共死亡7 只,生存率66.7%(圖2B)。

表1 不同濃度酒精飼料和對(duì)照飼料的配方Table 1 ingredients of different concentrations of alcohol feed and control feed

2.2 模型小鼠心臟整體結(jié)構(gòu)和功能分析

流體飼料喂養(yǎng)8 周后,對(duì)兩組小鼠進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn),無(wú)論在舒張期還是收縮期,左心室前后壁厚度以及左心室腔內(nèi)徑均有顯著差異,并且心臟功能也出現(xiàn)明顯差異。 WT+Alc 組小鼠較WT 組變化差異具體描述如下:舒張期左室前壁厚度(LVAW；d)減少13.40 %(WT 組:(0.97± 0.11)mm,WT+Alc 組:(0.84± 0.11) mm；P=0.025),收縮期左室前壁厚度(LVAW； s)減少10.94 %(WT組:(1.28 ± 0.13) mm,WT+Alc 組:(1.14 ± 0.16)mm；P = 0.026)(圖2A)；舒張期左室后壁厚度(LVPW；d)減少20.88 %(WT 組:(0.91±0.18)mm,WT+Alc 組:(0.72 ± 0.08)mm；P=0.004),收縮期左室后壁厚度(LVPW； s)減少14.00%(WT組:(1.00 ± 0.12) mm,WT+Alc 組:(0.86 ± 0.08)mm；P=0.003)(圖3B)；舒張期左室內(nèi)徑(LVID；d)增加11.83%(WT 組:(3.72±0.29) mm,WT+Alc組:(4.16 ± 0.39) mm；P=0.011),收縮期左室內(nèi)徑(LVID； s)增加19.17%(WT 組:(2.66 ± 0.33)mm,WT+Alc 組:(3.17 ± 0.49) mm；P=0.011)(圖3C)；射血分?jǐn)?shù)(EF%)增加18.47%(WT 組:(59.06± 6.65)%,WT+Alc 組:(48.15 ± 9.40)%；P =0.029),短軸縮短率(Fs%)增加16.49%(WT 組:(28.87 ± 4.32) %,WT+Alc 組:(24.11 ± 5.54)%；P=0.028)(圖3D)。 綜上所述,WT+Alc 組小鼠較WT 組心室前后壁厚度均有顯著減少,左室腔內(nèi)徑顯著增大,射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率降低,出現(xiàn)明顯的心臟功能降低的表型。

圖1 酒精性心肌病小鼠模型構(gòu)建方法Note. A, the fluid feed bottle and how to set up the bottle rack. B, the control group mice were given control feed for eight weeks. The alcoholic group (Alc group) mice were fed with liquid feed containing different high-concentrations of alcohol every two weeks, and the alcohol concentration was changed from 4.8%-5.4%.Figure 1 Establishing a mouse model of alcoholic cardiomyopathy

圖2 酒精性心肌病模型體重和生存情況監(jiān)測(cè)Note. A, mouse weight monitoring,*P ＜0.05. B, survival curve. WT, wild type control mice, n=9. WT-Alc, wild type mice were fed with alcohol feed, n=21.Figure 2 The body weights and survival of alcoholic cardiomyopathy model mice were monitored

2.3 模型小鼠呈現(xiàn)典型的擴(kuò)張型心肌病病理表型

流食喂養(yǎng)8 周后,將兩組小鼠心臟進(jìn)行取材,稱(chēng)量心臟濕重,為了減少重量誤差,所有小鼠取材過(guò)程保持基本一致。 本研究發(fā)現(xiàn)WT+Alc 組小鼠心重/體重指數(shù)較WT 組升高了12.20% (WT 組:(4.12±0.28) mg/g；WT+Alc 組:(4.57±0.48) mg/g；P=0.035)(圖4A)。 同時(shí)心臟M 型超聲截圖和整個(gè)心臟組織H&E 染色結(jié)果均顯示,WT+Alc 組小鼠的心臟組織確實(shí)較WT 組顯著增大,并且左室心腔增大明顯,超聲結(jié)果左室壁厚度明顯降低以及心臟功能降低(圖4D、C)。 因此,WT+Alc 組小鼠的心臟表現(xiàn)出了典型的心腔變大、室壁變薄、心臟功能下降的酒精性心肌病的臨床表型。 上述結(jié)果充分表明,利用流食添加乙醇喂養(yǎng)方法可以成功構(gòu)建酒精性心肌病小鼠模型,為酒精性心肌病機(jī)制的研究提供良好的動(dòng)物模型。

3 討論

酒精性心肌病臨床表型與擴(kuò)張型心肌病極其相似,均以心室擴(kuò)張、心肌功能降低為主要表現(xiàn),但是發(fā)病機(jī)制截然不同。 所以對(duì)于表型相同,但是發(fā)病機(jī)制不同的疾病,動(dòng)物模型需要有針對(duì)性的應(yīng)用。 由于酒精性心肌病主要由飲酒導(dǎo)致,因此本研究基于飲酒這一特征,進(jìn)行了酒精性心肌病模型的構(gòu)建。 本研究利用添加了乙醇的成分明確、能量平衡的Lieber-DeCarli 流質(zhì)飼料進(jìn)行長(zhǎng)期的喂養(yǎng),成功構(gòu)建了典型的心室擴(kuò)張、室壁變薄和心室功能不全的酒精性心肌病小鼠模型。

目前, 酒精性心肌病模型主要以小鼠為主[10-12],也有利用犬等大動(dòng)物制備模型的,但使用較少[13]。 由于小鼠的體型較小、繁殖能力強(qiáng)以及成熟的基因工程操作手段等原因,小鼠是使用最廣泛的模型之一。 關(guān)于酒精性心肌病模型,目前認(rèn)為C57BL/6 品系是最好的制備模型小鼠品系,其它品系如BALB/6 和DBA 要么不食用含有乙醇的飼料,要么會(huì)出現(xiàn)大量的死亡現(xiàn)象[14]。

酒精性心肌病小鼠模型制備方法主要分為乙醇灌胃法[15-18]、乙醇飲水法和液質(zhì)飼料喂養(yǎng)法[10-12]三種。 其中乙醇灌胃法是指將一定溶度的乙醇通過(guò)灌胃的方法直接注射到小鼠胃里面,由于模型制作一般需要較長(zhǎng)的時(shí)間,長(zhǎng)時(shí)間的灌胃對(duì)小鼠的咽、食道會(huì)造成反復(fù)的創(chuàng)傷,操作不當(dāng)還可能引起乙醇進(jìn)入氣管,死亡率高,還有的操作人員為了快速造模成功,短期內(nèi)大劑量給予乙醇灌胃,引起急性肝損傷或者急性胃擴(kuò)張,并且與臨床上酒精性心肌病慢性發(fā)展過(guò)程不相符；乙醇飲水法,是指經(jīng)乙醇加入到小鼠的日常飲水中進(jìn)行酒精性心肌病造模的方法。 這種方法操作簡(jiǎn)單,但是效果較差。 由于小鼠的個(gè)體差異,每只小鼠的飲水量不同,所以會(huì)造成較大差異,其次乙醇在飲水瓶中經(jīng)過(guò)幾天的揮發(fā),濃度也很難精準(zhǔn)控制,因此,此方法的缺陷相對(duì)較大,造模成功率也不高,目前采用此方法造模的文獻(xiàn)相對(duì)較少；

第三種方法是液質(zhì)飼料喂養(yǎng)法,這種方法是利用液體飼料喂養(yǎng)的方式進(jìn)行模型的制備。 其中液體飼料是通過(guò)蛋白質(zhì)、脂肪、維生素以及礦物質(zhì)等等按相應(yīng)比例配制成粉末溶解而成的成分清楚、營(yíng)養(yǎng)均衡的液體飼料,并且由于對(duì)照組較乙醇喂食組缺少了高能量的乙醇,利用麥芽糖糊精補(bǔ)充到對(duì)照組的飼料中,達(dá)到了飼料能量的均衡,使誤差減少到最低。 此種飼料盡可能控制了所有會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)和能量誤差的一種飼料,保證了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性,因此,這種方法也是目前國(guó)際上最流行一種制備酒精性心肌病模型的方法。 盡管液質(zhì)飼料制備酒精性心肌病模型已經(jīng)被普遍接受,但是乙醇濃度和造模周期并未統(tǒng)一,乙醇濃度從4%到10%,甚至有研究利用20%乙醇濃度進(jìn)行短暫喂養(yǎng),喂養(yǎng)過(guò)程中有的研究利用統(tǒng)一的喂養(yǎng)濃度,有的研究則采取了設(shè)置乙醇濃度梯度的喂養(yǎng)方式；由于乙醇濃度和喂養(yǎng)方式的不同,喂養(yǎng)周期也相差很大,總體來(lái)看最短的喂養(yǎng)時(shí)間是8 周,而最長(zhǎng)周期達(dá)到16 周齡[10,19-23]。本文利用了一種產(chǎn)自德國(guó)的Bio Serv 公司的一種營(yíng)養(yǎng)成分均衡、明確且精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)乙醇組和對(duì)照組之間能量平衡的目前國(guó)際廣泛應(yīng)用的液質(zhì)飼料Lieber-DeCarli[12],進(jìn)行了為期8 周的小鼠喂養(yǎng),并且乙醇濃度采取了梯度遞增(4.8%～5.4%)的喂養(yǎng)方式,最終成功得到了具有心腔變大、室壁變薄、心臟功能降低的典型的酒精性心肌病表型特征的小鼠。

圖3 8 周后心臟超聲評(píng)價(jià)酒精性心肌病模型小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能Note. A, Comparison of the left ventricular anterior wall thickness of the two groups of mice in the WT and WT+Alc groups. LVAW. d, the left ventricular anterior wall thickness during diastole. LVAW. s, the left ventricular anterior wall thickness during systole. B, Comparison of the left ventricular posterior wall thickness of the two groups. LVPW, d, diastolic left ventricular posterior wall thickness. LVPW. s, systolic left ventricular posterior wall thickness. C, Comparison of left ventricular diameter. LVID. d, left ventricle diameter during diastole. LVID； s, left ventricle diameter during systole. D, The cardiac ejection fraction and short-axis shortening rate were compared between the WT and WT+Alc groups. EF, ejection fraction, FS, fractional shorting, WT, wild mice fed a control diet, WT +Alc, wild mice fed an alcohol diet.Figure 3 Echocardiographic evaluation of cardiac structure and function after 8 weeks

圖4 酒精性心肌病小鼠模型呈現(xiàn)典型的擴(kuò)張型心肌病表型Note.A, the ratio of heart weight to body weight. WT group, n=9, WT+Alc group,n=14. B, the M-ultrasound image of the left ventricular short-axis from WT and WT+Alc groups. C, HE staining of longitudinal sections of the whole heart of mice in the WT and WT+Alc groups.Figure 4 A mouse model of alcoholic cardiomyopathy showing a typical dilated cardiomyopathy phenotype

盡管本研究成功構(gòu)建了酒精性心肌病模型,但是在模型的制備過(guò)程中,本研究也發(fā)現(xiàn)了問(wèn)題以及總結(jié)了經(jīng)驗(yàn)。 喂養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了小鼠體重下降的現(xiàn)象,雖然下降的絕對(duì)值不是很多,但是體重下降是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的,這一現(xiàn)象在前人的研究中也有發(fā)現(xiàn)[21]。 體重下降可能由于小鼠對(duì)液質(zhì)飼料適應(yīng)不足,為了克服體重下降,本文認(rèn)為可以給予每周一次的正常固體飼料,不僅在體重降低方面起到一定的緩解作用,而且也可能降低模型組小鼠的死亡率,這一方法將在今后的模型制備過(guò)程中加以應(yīng)用,期待獲得更好的效果。 另外,在模型的制備過(guò)程中,有些研究為了便于控制小鼠每天的飲食量[12-19],進(jìn)行兩只一籠的飼養(yǎng)方式,但是我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組存在一定的死亡率,出現(xiàn)死亡的飼養(yǎng)籠里面就會(huì)發(fā)生單只一籠的情況,獨(dú)籠飼養(yǎng)違背嚙齒類(lèi)動(dòng)物的生活習(xí)性以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理,因此在本研究中分組時(shí)采用了三只一籠的方法,這樣基本上不會(huì)出現(xiàn)單只飼養(yǎng)的情況,同時(shí)液體飼養(yǎng)瓶一次性所裝飼料也能夠滿(mǎn)足三只小鼠的一天所需的食量。

綜上,本研究應(yīng)用目前國(guó)際上廣泛認(rèn)可的流質(zhì)飼料進(jìn)行慢性乙醇喂養(yǎng),制備了表型良好的酒精性心肌病小鼠模型,為酒精性心肌病機(jī)制的研究提供了有力的工具。