王嫚詩,張 玲,秦 川,叢 斌

(1.國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,北京 100021；2.河北省法醫(yī)學重點實驗室,河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院,河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心,石家莊 050017)

突觸核蛋白相關路易體病是一種常見的中老年人癡呆性疾病,主要包括帕金森病癡呆(PDD)、路易氏體癡呆(DLB)[1-2]。 其病理特征主要為多巴胺能神經元缺失以及突觸核蛋白(α-synuclein)的沉積即路易氏小體(Lewy bodies,LBs)的形成[3]。 突觸核蛋白相關路易體病的主要癥狀表現(xiàn)為認知功能障礙以及帕金森病癥狀,包括早期出現(xiàn)進展性癡呆,后期伴隨錐體外系癥狀表現(xiàn)[4-5],并且其SNCA 基因中特定的遺傳變異可以影響臨床表型[6],其A53T 突變起病年齡早,生存期短[7]。 但在目前,沒有針對DLB 及PDD 確切的治療以及理想的動物模型。

此外,研究表明α-synuclein 沉積可以通過干擾線粒體外膜,影響線粒體融合與裂變,從而導致線粒體結構破壞[8-10],并且其A53T 突變能夠直接抑制線粒體呼吸鏈中復合物的活性,從而導致線粒體氧化應激,進而影響神經細胞的正常功能[11-12]。 在認知功能方面,神經突觸內的線粒體含量變化、電子傳遞鏈的改變直接影響神經元的傳遞[13-14],因此,保護線粒體形態(tài),維持線粒體穩(wěn)定可作為潛在的治療方向。

突觸核蛋白相關疾病至今仍無確切的治療措施,而有效的動物模型的建立及應用是解決問題的關鍵。 因此,本實驗通過行為學實驗對該模型進行運動,焦慮樣行為以及認知方面評價；結合免疫組化觀察小鼠不同腦區(qū)的突觸核蛋白沉積,多巴胺能神經元的變化；應用電鏡觀察其對線粒的影響,進而評價該模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級,雌雄各半,表達人α-synuclein A53T 突變的轉基因模型小鼠和野生型C57BL/6 小鼠各30只,10 月齡,體重20 ～30 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004],飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2018-0019]。 動物實驗方案獲中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)的批準(ILAS-QC-19004),并根據3R 原則對實驗動物的使用及飼養(yǎng)給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

引物購買于中國生工生物工程股份有限公司；Mouse Direct PCR Kit 購買于美國Biotool 公司；TH(EP1532Y)抗體,α-synuclein (EP1536Y)抗體,P-αsynuclein (ab59264)抗體購買于美國Abcam 公司；HRP 標記兔抗購買于北京中杉金橋生物技術有限公司；BSA(牛血清白蛋白)購買于德國SIGMA 公司；免疫組化試劑盒購買于北京中杉金橋生物技術有限公司；尼氏染色試劑盒購買于北京索萊寶科技有限公司。 EthoVision XT 動物軌跡跟蹤于行為觀察記錄分析系統(tǒng)購自荷蘭Noldus 公司；條件恐懼分析系統(tǒng)購于美國MED Associates 公司；轉棒分析系統(tǒng)購于中國淮北正華公司；抓力分析系統(tǒng)購于法國BIOSEB 公司；圓筒實驗裝置為自行設計；冰凍切片機購于美國SAKURA Tissue-Tek 公司；電鏡JEM-1400 購于日本電子公司；顯微鏡購于德國萊卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 轉基因陽性動物鑒定

子代小鼠出生8 ～14 d 內剪鼠尾,按照試劑盒說明加入組織消化液,配置20 μL 反應體系,上下游引 物 為: 5’-GAGGAAGGGTATCAAGACTACGAAC-3’； 5’-GCCGGATCATAATCAGCC ATACCAC-3’,參照文獻設置循環(huán)參數進行PCR 擴增基因型鑒定[15]。

1.3.2 認知、焦慮樣及運動行為學檢測

曠場行為學實驗可以反應小鼠的自主運動能力、探索能力及焦慮程度。 曠場實驗箱為40 cm×40 cm×40 cm 正方體,未有頂部遮蓋,上方懸掛攝像機。設置實驗箱內觀察區(qū),中央區(qū)及邊緣區(qū),記錄小鼠5 min 內運動時間,距離,平均運動速度,中央區(qū)及邊緣區(qū)停留時間。 圓筒實驗用于檢測小鼠在圓筒內的自發(fā)活動,主要包括小鼠在圓桶內的站立,理毛和前肢活動情況。 圓筒為一直徑7.5 cm 的圓柱型透明有機玻璃,未有頂部遮蓋,在圓筒前后方分別放有攝像機和鏡子,用于全方位觀測和量化小鼠自發(fā)活動情況。 實驗時將小鼠放入圓筒內,記錄3 min內小鼠的站立次數和理毛時間。 轉棒實驗用于評價小鼠的運動協(xié)調能力。 轉棒儀主要由轉軸和獨立隔間組成,實驗分3 d 進行,前2 d 為訓練期,轉速為10 r/min,每天訓練3 次,每次持續(xù)5 min；第3 d為測試期,從初始逐漸加速至40 r/min 共計5 min,每只小鼠檢測3 次,每次間隔20 min,取3 次均值記為在棒時間,實驗期間小鼠掉落系統(tǒng)自動停止記錄。

抓力實驗用于檢測小鼠的前肢肌張力,主要由抓力網格以及計算機檢測系統(tǒng)組成。 實驗時提起小鼠尾部,讓小鼠前肢抓取網格,由上至下輕拉小鼠尾部拖動小鼠,記錄拉力最大值,每只小鼠測試三次,取平均值。

Morris 水迷宮實驗用于檢測小鼠空間學習記憶行為。 設置水池內四個象限及隱藏平臺。 操作者每次從不同象限放入小鼠,共訓練7 d,第8 天撤掉平臺,進行探索實驗測試,記錄小鼠穿越平臺所在象限時間及次數。

條件恐懼實驗用于評價小鼠對恐懼場景的記憶,包括場景性條件恐懼及線索性條件恐懼,通過記錄小鼠僵直時間反應小鼠的恐懼程度。 實驗分4 d 進行,第1 天為適應期,第2 天給予電擊及聲音刺激,第3 天無任何刺激,第4 天更換場景僅給予聲音刺激。 第1 天設置光照強度為130 lx,將小鼠放入條件恐懼箱內適應10 min；第2 天設置光照強度為130 lx,電擊強度0.5 mA,聲音強度為80 db,刺激頻率為5000 hz。 將小鼠放入條件恐懼箱內,3 min 后給予單一頻率聲音刺激(30 s),于聲音刺激的最后2 s 給予電擊刺激,每段間隔1 min,10 min 內給予5次聲音及電擊刺激,記錄小鼠在恐懼箱10 min 內的僵直時間；第3 天設置光照強度為130 lx,無任何條件刺激,記錄小鼠5 min 內的僵直時間。 第4 天更換場景,放置黑板遮光,并在其側壁涂有帶有氣味的果汁。 光照強度、聲音刺激及檢測時間同第2 天,記錄小鼠在恐懼箱內僵直時間。

1.3.3 免疫組化觀察突觸核蛋白/路易小體沉積,TH 細胞變化

1)TH 染色及α-synuclein 染色

PBS 洗腦片后置于3%過氧化氫封閉液室溫孵育10 min,再次用PBS 沖洗3 次,每次10 min,置于BSA 孵育30 min,一抗(TH 抗體1 ∶5000 稀釋；αsynuclein 抗體1 ∶1000 稀釋)孵育過夜。 PBS 洗腦片后,二抗(兔抗1 ∶1000；鼠抗1 ∶1000)室溫孵育30 min,PBS 洗腦片4 次,每次5 min,DAB 顯色30 s。 取相同層面紋狀體,黑質,海馬貼片,烤片1 h,置于氯仿及酒精混合溶液(1 ∶1)過夜。

2)尼氏染色及計數

將玻片置于100%乙醇、95%乙醇梯度脫水各30 s,自來沖洗后甲酚紫染色,再用95%乙醇、100%乙醇梯度脫水各10 s,置于二甲苯30 s 后中性樹膠封片。將染色后的黑質及紋狀體置于顯微鏡下觀察并畫出黑質區(qū)域,用image J 軟件計數TH 陽性細胞數。

1.3.4 電鏡觀察線粒體形態(tài)變化

生理鹽水及多聚甲醛灌注后,取紋狀體經2.5%的戊二醛固定過夜后用1%鋨酸4℃固定2 h,蒸餾水沖洗后梯度乙醇脫水,環(huán)氧丙烷處理,樹脂浸透,包埋,制備超薄切片,染色后置于電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數據采用GraphPad Prism 6 軟件處理數據、作圖,結果采用平均數±標準差(±s)表示,以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉基因陽性動物的鑒定

部分α-synuclein A53T 小鼠基因鑒定結果見圖1,攜帶α-synuclein A53T 基因的陽性鼠可見清晰PCR 擴增條帶,與目的片段大小相符,陰性鼠無條帶(圖1)。

2.2 α-synuclein A53T 轉基因小鼠認知行為學改變

在曠場實驗中,α-synuclein A53T 轉基因小鼠表現(xiàn)為運動距離增加,但在中央區(qū)停留時間未見明顯統(tǒng)計學差異(圖2A～2C)；在圓筒實驗、轉棒實驗、抓力實驗(圖2D ～2E、圖3)及水迷宮實驗(圖4A ～4C)中,α-synuclein A53T 轉基因小鼠與Control 組小鼠相比均未見明顯統(tǒng)計學差異；在條件恐懼實驗中,α-synuclein A53T 轉基因小鼠在第場景依賴條件恐懼(海馬依賴,0～330 s)與線索依賴條件恐懼(杏仁核依賴,180 ～570 s)中表現(xiàn)為僵直時間縮短(圖4D～4E),具有統(tǒng)計學差異。

2.3 免疫組化觀察α-synuclein 沉積增多，TH 細胞減少

應用免疫組化染色評價α-synuclein A53T 轉基因小鼠α-synuclein,TH 變化。 P-α-synuclein 顯示α-synuclein A53T 轉基因小鼠紋狀體、黑質、梨狀皮層及海馬P-α-synuclein 沉積增多(圖5A)；Pα-synuclein 染色觀察小鼠前額葉路易氏小體的沉積,LB 的典型外觀是一個或多個嗜酸性球體,中間為致密核心,周邊為暈圈[16]如箭頭所示(圖5 B),紋狀體、黑質α-synuclein 增多(圖6)；TH 染色顯示A53T 轉基因小鼠黑質TH 陽性多巴胺能神經元減少(圖7),結果表明A53T 轉基因小鼠具有不同腦區(qū)α-synuclein 沉積及TH 細胞減少的病理特征。

2.4 電鏡觀察小鼠腦線粒體形態(tài)變化

文獻表明α-synuclein 可以直接影響線粒體呼吸鏈復合物的活性,從而導致線粒體氧化應激損傷。 電鏡結果顯示α-synuclein A53T 轉基因小鼠線粒體內容物,線粒體嵴結構不清；線粒體形態(tài)改變,裂變增多,提示α-synuclein 的沉積可以影響線粒體的結構及形態(tài)(見圖8)。

3 討論

α-synuclein A53T 相 關 小 鼠 模 型 具 有 αsynuclein 的聚集以及TH 細胞的減少,常被用做PD模型。 研究表明,不同外源啟動子調控表達的αsynuclein A53T 小鼠模型的表型有所差別,朊病毒啟動子主要在神經元表達[12]；Teto 啟動子主要在四環(huán)素誘導下表達[17]；thy1 啟動子主要在皮層以及皮層下神經元表達[18]。 此外,AAV1/2-A53T-α-synuclein誘導的小鼠模型,可在SN 中引起α-synuclein 的廣泛過表達,從而導致多巴胺能纖維丟失和紋狀體中多巴胺能神經遞質的減少,早期可伴有運動障礙[19]。

本實驗采用的小鼠為血小板源生長因子啟動子(PDGF-h-α-Synuclein) A53T 突變小鼠,PDGF-β啟動子可以在新皮層、嗅球、膠質細胞以及神經元中廣泛表達,并且據報道該小鼠具有α-synuclein 的沉積以及進行性運動障礙[20]。

圖1 部分α-synuclein A53T 小鼠PCR 鑒定凝膠電泳圖Figure 1 PCR identification of α-synuclein A53T mice by gel electrophoresis

圖2 α-synuclein A53T 小鼠焦慮樣行為學表現(xiàn)Note. A, The experimental area of the open field test. B ～C, Comparison of distance moved and cumulative duration spent in zone C. D ～E,Comparison of grooming and rearing time in the Cylinder test.Compared with the control group,*P ＜0.05.Figure 2 Anxiety behavior in α-synuclein A53T mice

在α-synuclein A53T 轉基因小鼠模型中,12 月齡A53T 小鼠可以出現(xiàn)明顯的運動學障礙表現(xiàn)[21],此外,朊病毒啟動子調控表達的α-synuclein A53T小鼠在6 月齡出現(xiàn)空間記憶障礙,以及減少的焦慮樣行為,并且空間記憶缺陷隨著月齡增長而發(fā)展[12]。 但對 于PDGF-β 啟 動 子 調 控 表 達 的αsynuclein A53T 小鼠并未有系統(tǒng)的認知、運動及焦慮樣行為學評價。

圖3 α-synuclein A537 小鼠運動行為學表現(xiàn)Note. A, Comparison of duration in the rotating rod test. B,Comparison of maximum strength.Figure 3 Motor behavior in α-synuclein A53T mice

在本實驗中,PDGF-β 啟動子調控表達的αsynuclein A53T 小鼠運動距離增加,呈現(xiàn)過度活躍狀態(tài),同之前的研究相符[22]；而焦慮樣及運動學評價未顯示明顯統(tǒng)計學差異,表明10 月齡時α-synuclein A53T 轉基因小鼠并未有焦慮癥狀以及明顯運動學癥狀改變,在認知行為學評價中,海馬及杏仁核依賴的條件孔恐懼記憶時間縮短,表明10 月齡αsynuclein A53T 轉基因小鼠出現(xiàn)認知記憶障礙,但是對于水迷宮實驗中空間學習記憶能力并未有明顯改變,因此在PDGF-β 啟動子調控表達的10 月齡αsynuclein A53T 小鼠模型中,行為學檢測表現(xiàn)為條件恐懼認知功能障礙,并且其發(fā)生早于運動功能障礙,以及未見明顯的焦慮樣行為改變。 免疫組化實驗中,在黑質、紋狀體、梨狀皮層、海馬觀察到P-αsynuclein 沉積,前額葉皮層中觀察到LBs,并且研究表明,在突觸核蛋白相關路易氏體疾病中,大部分α-synuclein 沉積在129 位絲氨酸是磷酸化的,而在正常人中僅有少部分是磷酸化的[23]。 此外,在αsynuclein 染色中黑質紋狀體α-synuclein 有明顯改變,TH 染色觀察黑質中多巴胺能神經元減少,符合突觸核蛋白相關路易氏體疾病中類似PD 的病理表現(xiàn),并且電鏡觀察顯示,與對照組相比,10 月齡αsynuclein A53T 轉基因小鼠線粒體內容物不清,形態(tài)發(fā)生改變,裂變增多[24],以上實驗結果符合突觸核蛋白相關疾病(路易氏體癡呆/帕金森病癡呆)報道[1-2]。

綜上所述,在本實驗研究中,10 月齡PDGF-β啟動子調控表達的α-synuclein A53T 小鼠在行為學表現(xiàn)為認知功能障礙先于運動功能障礙,在病理學表現(xiàn)為磷酸化突觸核蛋白的沉積以及多巴胺能神經元減少,線粒體裂變增多,進而提出該小鼠可作為一種突觸核蛋白相關認知障礙性疾病如(路易氏體癡呆/帕金森病癡呆)相關的動物模型,為αsynuclein 引起的認知障礙性疾病的機制研究與藥物開發(fā)提供支撐。

圖4 α-synuclein 小鼠認知行為學表現(xiàn)Note. A,Latency to find the hidden platform during 7 consecutive days of training. B-C,Time and frequency of crossing of the quadrant containing the platform. D-E, Freezing time in the context memory test and cued memory test.Compared with the control group, *P ＜0.05,**P ＜0.01.Figure 4 Cognitive behavior in α-synuclein A53T mice

圖5 不同腦區(qū)P-α-synuclein 沉積Note. A, P-α-synuclein accumulation in the substantia nigra (SN), striatum (STR), piriform cortex (PIR), and hippocampus (HIP) of αsynuclein A53T mice. B, Lewy-body (LBs) deposition in the prefrontal cortex.Figure 5 P-α-synuclein deposition in different brain regions in α-synuclein A53T mice

圖6 黑質、紋狀體中α-synuclein 沉積Figure 6 α-synuclein deposition in the SN and STR of α-synuclein A53T mice

圖7 小鼠腦黑質多巴胺能神經元變化Note. A, Immunohistochemical staining showed TH expression in the SN. B, Quantification of TH-positive cells in the SN.Figure 7 TH expression in the SN of α-synuclein A53T mice

圖8 電鏡下小鼠腦線粒體變化Figure 8 Mitochondrial morphology in the amygdala of α-synuclein A53T mice