劉文靜丁小瓊王旭東楊軍

1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南京210009)

2皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(蕪湖241000)

3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(上海200082)

上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海200029)

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所 (上海200029)

高遷移率族蛋白(High Mobility Group，HMG)是一類進(jìn)化高度保守的非組蛋白，主要分布在真核細(xì)胞的胞核內(nèi)。根據(jù)HMG分子量大小、結(jié)構(gòu)相似性和DNA結(jié)合特性，將其分為HMGA、HMGB和HMGN家族[1]，其中HMGB家族表達(dá)最為豐富。HMGB家族又包括HMGB1、HMGB2及HMGB3。在HMGB家族3個成員中，HMGB1研究最多最深入。HMGB1在胞核中主要與DNA結(jié)合，參與細(xì)胞復(fù)制、DNA的重組、基因轉(zhuǎn)錄等生命活動[2]。HMGB1不僅在腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷等疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[3-5]，也可作為轉(zhuǎn)錄因子及生長因子，參與多種細(xì)胞分化及增殖過程，例如脊髓細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞再生、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及神經(jīng)元分化等[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在內(nèi)耳組織表達(dá)的變化與阿卡米星及順鉑對大鼠的耳毒性作用密切相關(guān)[10,11]。方佳等[12]報道HMGB1表達(dá)分布在正常成年小鼠耳蝸中Corti器感覺毛細(xì)胞、Deiters細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元，這表明HMGB1可能在聽覺功能中發(fā)揮十分重要的作用。有研究報道HMGA家族成員之一的HMGA2在發(fā)育中小鼠耳蝸呈時空特異性表達(dá)，并與耳蝸發(fā)育密切關(guān)聯(lián)[13]，HMGB1在正常小鼠耳蝸發(fā)育過程中是否也有類似作用，目前尚無文獻(xiàn)報道。為此，本研究擬通過觀察HMGB1在出生后不同鼠齡小鼠耳蝸中的時空表達(dá)分布，分析其在小鼠耳蝸發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用，從而為耳蝸發(fā)育機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

挑選10周齡健康BALB/c小鼠8對作為種鼠，雄鼠體重25±2g，雌鼠體重20±2g，每對種鼠提供1個年齡段的新生鼠。按照出生后的天數(shù)將小鼠分為出生后1天(P1)、7天(P7)、12天(P12)、17天(P17)、21天(P21)以及成年小鼠(＞2月齡)共6組，每組6只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本制備

將小鼠用預(yù)冷4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，迅速斷頭，置入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液，在解剖顯微鏡(Leica，德國)下分離耳蝸組織，開放圓窗及卵圓窗，蝸頂打孔，玻璃吸管經(jīng)蝸尖打孔處行耳蝸內(nèi)灌注，室溫后固定1h。P7及P7以上鼠齡的耳蝸置于10%EDTA 4°C酌情脫鈣，15%蔗糖溶液4°C浸泡3h，后放入30%蔗糖溶液4°C浸泡8h。濾紙吸干耳蝸表面液體，OCT(optimal cutting temperature)包埋劑4°C包埋3h，沿耳蝸蝸軸水平作冰凍切片(Leica恒冷冰凍切片機(jī))，片厚8μm。

1.2.2 雙重免疫熒光染色

耳蝸冰凍切片室溫晾干，PBS洗OCT膠；0.3%Triton X-100/10%驢血清溶液室溫通透封閉30 min，PBS漂洗，滴加抗HMGB1兔多克隆抗體(1:200，Abcam公司)以及抗Sox2山羊單克隆抗體(1:200，Santa Cruz Biochemicals公司)4℃孵育過夜，用PBS代替一抗作空白對照，PBS漂洗，加抗兔Alexa Fluor 546(1:200，碧云天公司)和 IFKine? Green Donkey Anti-Goat IgG(1:200，博士德公司)室溫孵育2h，PBS漂洗，載玻片上滴加DAPI(1:800，碧云天公司)后封片。激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)下觀察、拍照，激發(fā)波長分別為561nm、488nm以及405nm。P1、P7、P12、P21和成年期5個年齡段每只小鼠隨機(jī)選取1張耳蝸冰凍切片激光共聚焦成像，然后用圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)分別在每張圖片Corti器的內(nèi)、外毛細(xì)胞和Deiter cells以及螺旋神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域共選取5個不同的細(xì)胞，軟件檢測HMGB1在5個不同的細(xì)胞陽性染色的平均光密度值(Average optical densities，AOD)，最后做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.3 統(tǒng)計分析

GraphPad Prism 6.0做圖，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0（SPSS Inc.,美國）統(tǒng)計軟件行單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳蝸側(cè)壁HMGB1的表達(dá)

新生小鼠耳蝸側(cè)壁尚未發(fā)育成熟，構(gòu)成血管紋的3層細(xì)胞未完全形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1在耳蝸側(cè)壁胞核的表達(dá)自出生即出現(xiàn)(圖1A)。P7組，血管紋3層細(xì)胞清晰可見，細(xì)胞間隙擴(kuò)大。HMGB1表達(dá)在血管紋中央?yún)^(qū)域的血管，血管紋緣細(xì)胞、中間細(xì)胞和連接螺旋韌帶的基底細(xì)胞。HMGB1胞核表達(dá)也出現(xiàn)在螺旋韌帶纖維細(xì)胞與螺旋韌帶內(nèi)血管(圖1B)。P12組，血管紋及螺旋韌帶基本發(fā)育成熟，HMGB1的表達(dá)繼續(xù)在血管紋、螺旋韌帶以及耳蝸側(cè)壁血管(圖1C-D)。在P17和P21組，HMGB1在耳蝸側(cè)壁的表達(dá)分布與P12組基本一致(圖1E-G)，并持續(xù)至成年期(圖 1H-I)。

圖1 耳蝸側(cè)壁HMGB1的表達(dá)。A：P1組，HMGB1胞核表達(dá)在血管紋、螺旋韌帶和外凹細(xì)胞。B-I：從P7至成年期，血管紋3層細(xì)胞、螺旋韌帶、血管紋以及螺旋韌帶內(nèi)的血管（三角形）均有HMGB1的表達(dá)。m：血管紋緣細(xì)胞；i：中間細(xì)胞；b：基底細(xì)胞；os：外凹細(xì)胞；SL：螺旋韌帶；SV：血管紋。Fig.1 The expression of HMGB1 in the cochlear lateral wall.A:At P1,nuclear HMGB1 staining was located in the stria vascularis and spiral ligament and outer sulcus.B-I:From P7 to adult,HMGB1 was expressed in the stria vascularis,blood vessels(arrowhead)of the stria vascularis and the spiral ligament.m:strial marginal cells;i:intermediate cells;b:basal cells;os,outer sulcus;SL:spiral ligament;SV:stria vascularis.

2.2 聽覺上皮HMGB1的表達(dá)

在P1和P7組，HMGB1除了表達(dá)在Corti器中的內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞外，Deiters細(xì)胞、柱細(xì)胞、Hensen細(xì)胞以及大上皮嵴也出現(xiàn)HMGB1的表達(dá)，并與支持細(xì)胞標(biāo)記蛋白Sox2共表達(dá)(圖2A-F)。另外，襯覆基底膜鼓階面的鼓室邊緣細(xì)胞可見HMGB1的表達(dá)。從P7起，HMGB1開始表達(dá)在內(nèi)毛細(xì)胞突觸區(qū)的神經(jīng)纖維末梢(圖2D)。P12組大上皮嵴細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)出現(xiàn)變化，大上皮嵴“嵴突”消失，而內(nèi)凹細(xì)胞明顯可見。HMGB1與Sox2共表達(dá)在大上皮嵴未完全退化的殘留柱狀細(xì)胞(圖2G-I)。隨著P17組大上皮嵴完全退化解體，HMGB1與Sox2在大上皮嵴的共表達(dá)也消失(圖3A-C)。P21和成年期，HMGB1與Sox2的表達(dá)分布未見明顯改變，鼓室邊緣細(xì)胞仍有HMGB1的胞核表達(dá)(圖 3D-I)。

圖2 P1、P7和P12組聽覺上皮HMGB1及Sox2的表達(dá)。A、D、G：HMGB1表達(dá)在大上皮嵴、Corti器毛細(xì)胞、柱細(xì)胞、Deiters細(xì)胞以及Hensen細(xì)胞。鼓室邊緣細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞基底部的神經(jīng)纖維末梢（箭頭）也有HMGB1的表達(dá)。P12組，HMGB1在內(nèi)凹細(xì)胞的表達(dá)顯著。B、E、H：Sox2表達(dá)在大上皮嵴、Corti器支持細(xì)胞。C、F、I為DAPI、HMGB1和Sox2的疊加成像。ger：大上皮嵴；ihc：內(nèi)毛細(xì)胞；ohc：外毛細(xì)胞；dc：Deiters細(xì)胞；pc：柱細(xì)胞；hc：Hensen細(xì)胞；tbc：鼓室邊緣細(xì)胞；is：內(nèi)凹細(xì)胞。Fig.2 The expression of HMGB1 and Sox2 in the auditory epithelium at P1,P7 and P12.A、D、G:HMGB1 was expressed in the greater epithelial ridge,the inner and outer hair cells of the organ of Corti,pillar cells,Deiters cells,Hensen’s cells,the tympanic border cells and nerve fibers(arrows).At P12,the expression of HMGB1 in the inner sulcus cells was visible.B、E、H:Sox2 immunostaining was present in the greater epithelial ridge cells and supporting cells of the organ of Corti,C、F、I represented the merged images.ger,greater epithelial ridge;ihc,inner hair cells;ohc,outer hair cells;pc,pillar cells;dc,Deiters cells;hc,Hensen’s cells;tbc,tympanic border cells;is,inner sulcus cells.

圖3P17、P21和成年組聽覺上皮HMGB1及Sox2的表達(dá)。A、D、G：各組均可見HMGB1表達(dá)在Corti器內(nèi)指細(xì)胞、毛細(xì)胞、Deiters細(xì)胞、Hensen細(xì)胞、鼓室邊緣細(xì)胞及外周神經(jīng)纖維末梢（箭頭）。B、E、H：各組均可見Sox2表達(dá)在Corti器支持細(xì)胞。C、F、I為DAPI、HMGB1和Sox2的疊加成像。ipc：內(nèi)指細(xì)胞；ihc：內(nèi)毛細(xì)胞；ohc：外毛細(xì)胞；dc：Deiters細(xì)胞；pc：柱細(xì)胞；hc：Hensen細(xì)胞；tbc：鼓室邊緣細(xì)胞；is：內(nèi)凹細(xì)胞。Fig.3 The expression of HMGB1 and Sox2 in the auditory epithelium at P17,P21 and adult.A、D、G:HMGB1 was expressed in the inner phalangeal cells,the inner and outer hair cells,pillar cells,Deiters cells,Hensen’s cells,the tympanic border cells and peripheral nerve fibers(arrows).B、E、H:Sox2 was expressed in the supporting cells of the organ of Corti.C、F、I represented the merged images.ipc,inner phalangeal cells;ihc,inner hair cells;ohc,outer hair cells;pc,pillar cells;dc,Deiters cells;hc,Hensen’s cells;tbc,tympanic border cells;is,inner sulcus cells.

2.3 螺旋緣HMGB1的表達(dá)

HMGB1在P1組表達(dá)在小鼠耳蝸螺旋緣內(nèi)齒細(xì)胞、纖維細(xì)胞及螺旋緣內(nèi)血管(圖4A)。P7組，內(nèi)凹細(xì)胞開始形成。HMGB1表達(dá)出現(xiàn)在投射到骨性螺旋板的外周神經(jīng)纖維及內(nèi)凹細(xì)胞(圖4B)。P12組至成年期，HMGB的表達(dá)繼續(xù)在耳蝸外周神經(jīng)纖維、螺旋緣細(xì)胞及螺旋緣內(nèi)的血管(圖4C-F)。

圖4 螺旋緣HMGB1的表達(dá)。A：P1組，HMGB1胞核染色分布在內(nèi)齒細(xì)胞和位于其下方的纖維細(xì)胞以及螺旋緣內(nèi)的血管（三角形）。B：P7組，內(nèi)凹細(xì)胞和骨性螺旋板的外周神經(jīng)纖維（箭頭）可見HMGB1的表達(dá)。C-E：P12、P21和成年組，HMGB1的表達(dá)在螺旋緣、螺旋緣內(nèi)的血管以及外周神經(jīng)纖維。idc:內(nèi)齒細(xì)胞；sb:螺旋緣。Fig.4 HMGB1 was expressed in the spiral limbus.A:At P1,nuclear HMGB1 staining was detected in the interdental cells and fibrocytes of the spiral limbus as well as the blood vessels(arrowhead).B:At P7,HMGB1 was expressed in the inner sulcus and peripheral nerve fibers(arrows).C-E：At P12,P21 and adult,HMGB1 was sustained in the spiral limbus and the blood vessels of the spiral limbus as well as peripheral nerve fibers.idc:the interdental cells;sb:spiral limbus.

2.4 螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)HMGB1的表達(dá)

在P1、P7組螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)，HMGB1為胞核染色。HMGB1表達(dá)分布在螺旋神經(jīng)元和其周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，HMGB1與Sox2蛋白共表達(dá)在包裹螺旋神經(jīng)元的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖5A-F)。P12組，HMGB1除了表達(dá)在螺旋神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞核外，螺旋神經(jīng)元胞漿亦見HMGB1的表達(dá)(圖5G-I)。P17、P21和成年組螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)，HMGB1的表達(dá)主要分布在螺旋神經(jīng)元的胞核，但仍可見其在胞漿及胞核區(qū)(圖 6A-I)。

2.5 免疫熒光半定量分析

P1、P7、P12、P21和成年組Corti器內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞HMGB1的平均光密度值無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.672、0.731，P=0.516、0.562＞0.05)。 P1、P7、P12、P21和成年組Deiters細(xì)胞HMGB1的平均光密度值分別為0.0496±0.0006、0.1017±0.0056、0.0941±0.0076、0.1020±0.0107和0.1371±0.0198，且P1組平均光密度值與P7、P12、P21和成年組相比，有顯著性差異(F=4.125、P=0.017*＜0.05)(圖7A)。P1、P7、P12、P21和成年組螺旋神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的平均光密度值差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.379、0.412，P=0.796、0.801＞0.05)(圖7B)。

圖5P1、P7和P12組螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)HMGB1和Sox2的表達(dá)。A、D:P1和P7組，HMGB1的胞核表達(dá)在“圓形”螺旋神經(jīng)元及“梭形”神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。G:P12組，少數(shù)螺旋神經(jīng)元胞核和胞質(zhì)（箭頭）出現(xiàn)HMGB1的表達(dá)。B、E、H：各組均可見Sox2表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。C、F、I為DAPI、HMGB1和Sox2的疊加成像。Fig.5 The expression of HMGB1 and Sox2 in the spiral ganglion area at P1,P7 and P12.A、D:HMGB1 immunostaining was detected in the round-shaped nuclei of spiral ganglion neurons and spindle-shaped glial cell nuclei at P1 and P7.G:Note some spiral ganglion neurons(arrows)exhibited cytoplasmic and nuclear HMGB1 immunolabeling at P12.B、E、H：Sox2 was expressed in the glial cell at P1,P7 and P12.G:C、F、I represented the merged images.

圖6 P17、P21和成年組螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)HMGB1和Sox2的表達(dá)。A、D、G:各組HMGB1主要表達(dá)在胞核，一些螺旋神經(jīng)元胞核和胞質(zhì)（箭頭）可見HMGB1的表達(dá)。B、E、H：Sox2表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。C、F、I為DAPI、HMGB1和Sox2的疊加成像。Fig.6 The expression of HMGB1 and Sox2 in the spiral ganglion area at P17,P21 and adult.HMGB1 immunoreactivity remained in the cell nuclei.Some spiral ganglion neurons(arrows)exhibited cytoplasmic and nuclear HMGB1 immunolabeling.B、E、H：Sox2 was expressed in the glial cell.C、F、I represented the merged images.

圖7 HMGB1在P1、P7、P12、P21和成年組小鼠Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)免疫熒光平均光密度值（AOD）統(tǒng)計學(xué)分析(n=30，每年齡組各6只)。A、B:HMGB1在各組Corti器中內(nèi)、外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)均無明顯差異。但在Deiters細(xì)胞，P1組與P7、P12、P21和成年組相比，HMGB1表達(dá)有顯著性差異。其中*代表P＜0.05，**代表P ＜0.01。Fig.7 A,B Statistical analysis of the average optical densities of HMGB1 in the organ of Corti and spiral ganglion at P1,P7,P12,P21 and adult(n=30,divided into five groups of six mice each).A、B:There was no significant difference in the expression of HMGB1 in the inner and outer hair cells,spiral ganglion neurons and glial cells between P1 compared with P7,P12,P21 and adult(P＞0.05).There were significant differences in the average optical densities of HMGB1 in the Deiters cells between P1 with P7,P12,P21 and adult(P＜0.05).Significance of one-way ANOVA and least significant difference T test.*P ＜0.05，**P＜0.01.

3 討論

HMGB1存在于幾乎所有的真核生物細(xì)胞內(nèi)，例如內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等[14-17]。本研究中，HMGB1在出生后小鼠耳蝸發(fā)育的各階段都有表達(dá)，并廣泛分布于耳蝸不同的細(xì)胞。通過分析HMGB1在出生后小鼠耳蝸不同發(fā)育階段不同細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在不同時期的Corti器感覺毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，HMGB1的表達(dá)無明顯差異。但在不同年齡段的Deiters細(xì)胞，HMGB1存在表達(dá)差異。HMGB1在這些耳蝸細(xì)胞中執(zhí)行的功能目前尚不清楚。研究已證實(shí)，出生后哺乳動物的聽覺感覺上皮仍具有增殖、分化的潛能[18,19]，尤其是出生后早期階段的大上皮嵴柱狀細(xì)胞和鼓室邊緣細(xì)胞可始終保持一種慢循環(huán)狀態(tài)，在特定條件下具備干細(xì)胞的特性和功能[20,21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB在各個階段的鼓室邊緣細(xì)胞、Corti器感覺毛細(xì)胞及支持細(xì)胞中均特異性表達(dá)。大上皮嵴是耳蝸發(fā)育過程中的一個暫態(tài)結(jié)構(gòu)，在小鼠出生兩周后被內(nèi)凹細(xì)胞代替。Sme-ti等[13]的研究結(jié)果顯示在大上皮嵴HMGA2與Sox2的共表達(dá)僅出現(xiàn)在胚胎發(fā)育晚期，新生小鼠的大上皮嵴細(xì)胞并無表達(dá)。研究已證實(shí)，Sox2可作為發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子，對發(fā)育過程中細(xì)胞分裂與分化的維持發(fā)揮十分重要的作用[22]。Sox2已被證實(shí)參與哺乳動物的聽覺上皮細(xì)胞的分化與形成過程[23]，Sox2基因敲除將導(dǎo)致耳蝸Corti器與大上皮嵴細(xì)胞混雜無法區(qū)分界限[24]。因此推測，HMGB1可能參與調(diào)控早期階段聽覺感覺上皮的發(fā)育與成熟過程。內(nèi)淋巴電位(EP)主要通過耳蝸外側(cè)壁分泌K+入中階而產(chǎn)生[25]，EP通常在小鼠出生后第6天開始出現(xiàn)，在毛細(xì)胞聲音轉(zhuǎn)導(dǎo)具有極其重要的作用。螺旋緣、外凹細(xì)胞及螺旋韌帶可通過參與內(nèi)外淋巴液K+循環(huán)對EP的維持發(fā)揮十分重要的作用[26]。此外，耳蝸微循環(huán)在EP的形成中也起重要的作用，耳蝸微循環(huán)紊亂可導(dǎo)致聽覺功能的障礙[27]。在出生后早期階段的螺旋緣、耳蝸外側(cè)壁以及外側(cè)壁內(nèi)的毛細(xì)血管均可見HMGB1的表達(dá)，提示HMGB1可能通過參與促進(jìn)正常EP的產(chǎn)生與維持，從而對正常聽覺的形成發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，HMGB1在螺旋神經(jīng)元的表達(dá)呈現(xiàn)年齡相關(guān)性改變。在新生小鼠，HMGB1集中表達(dá)在螺旋神經(jīng)元的胞核。從P12到成年組，一些螺旋神經(jīng)元胞漿和胞核均有HMGB1的表達(dá)分布。在其他正常組織細(xì)胞中，HMGB1也有報道在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)均有表達(dá)。例如大腦神經(jīng)元、羊膜上皮細(xì)胞及造釉細(xì)胞等[28-30]。然而，HMGB1亞細(xì)胞定位的改變在小鼠正常發(fā)育過程中的生物學(xué)功能尚不完全清楚。有研究報道，在缺氧、營養(yǎng)供應(yīng)不足、氧化應(yīng)激等多種刺激因素作用下，HMGB1可從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，參與細(xì)胞自噬、凋亡及壞死等過程[31,32]。神經(jīng)元的胞核在神經(jīng)組織中扮演著神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)因子的角色[33]，其周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有支持、營養(yǎng)及保護(hù)的功能[34]。在螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與HMGB1共表達(dá)的Sox2已被證實(shí)具有促進(jìn)螺旋神經(jīng)元的生長、發(fā)育及功能維持的作用[35]，這說明HMGB1可能參與正常小鼠螺旋神經(jīng)元發(fā)育過程。另外，HMGB1在聽覺形成前開始表達(dá)在支配內(nèi)毛細(xì)胞的外周神經(jīng)纖維。已有研究報道，出生后早期的小鼠耳蝸發(fā)生軸突生長、突觸形成、軸突退縮、突觸重組等一些關(guān)鍵事件，確保螺旋神經(jīng)元發(fā)出的軸突形成正確的突觸連接，從而完成聽覺信息準(zhǔn)確傳遞[36]。這進(jìn)一步說明在小鼠外周聽覺神經(jīng)通路發(fā)育過程中，HMGB1表達(dá)變化可能在聽覺神經(jīng)傳遞的建立起重要的作用。

綜上所述，HMGB1廣泛表達(dá)在不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸，其主要表達(dá)分布于血管紋、螺旋韌帶、螺旋緣、Corti器、螺旋神經(jīng)元等處，提示HMGB1的表達(dá)可能與耳蝸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、聽覺通路的建立和聽覺形成密切相關(guān)。HMGB1在聽覺形成前的動態(tài)表達(dá)表明其可能在小鼠耳蝸的形態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮十分重要的作用。