佘宇奇，劉 瓊，周儉輝，戴立忠，鄧 勇，李 寧

(1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院輸血科，湖南 長沙 410008； 2. 湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410006； 3. 湖南圣湘科技股份有限公司研發(fā)部，湖南 長沙 410205)

2019年12月以來，湖北武漢市暴發(fā)多例新型冠狀病毒(2019-nCoV)肺炎[1]，隨后迅速席卷全國。截至2020年2月21日24時(shí)，中國大陸累計(jì)確診2019-nCoV肺炎76 288例，死亡2 345例[2]。2019-nCoV主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播，在相對封閉的環(huán)境中長時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能[3]，有報(bào)道在糞便中也檢出2019-nCoV[4-5]。新型冠狀病毒肺炎潛伏期1～14 d，也有文獻(xiàn)報(bào)道最長為24 d，人群普遍易感[6]。2019-nCoV與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)同屬于β屬的冠狀病毒，滅活SARS-CoV的方法同樣能夠滅活2019-nCoV[7]。SARS-CoV病毒對紫外線和熱敏感，56℃ 30 min、丙醇、乙醇等均可有效滅活病毒[8-9]。

2019-nCoV傳染性很強(qiáng)，對未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作要求在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)[10]。在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測過程中需要多次接觸患者標(biāo)本，如編號、離心、混勻、開蓋、加樣和轉(zhuǎn)移等，同時(shí)操作中會(huì)產(chǎn)生大量氣溶膠，每多一次操作均會(huì)增加實(shí)驗(yàn)室工作人員感染的概率。減少與病毒的接觸是降低實(shí)驗(yàn)室工作人員感染最簡單、有效的辦法。實(shí)驗(yàn)室可以通過增加防護(hù)物資，提高防護(hù)等級阻斷病毒向工作人員傳播。但2019-nCoV疫情的發(fā)生臨近春節(jié)長假，防護(hù)裝備生產(chǎn)廠家都已停工，防護(hù)裝備緊缺，特別是2019-nCoV疫情發(fā)源地武漢。若安全防護(hù)不到位，很大程度上增加實(shí)驗(yàn)室工作人員感染的風(fēng)險(xiǎn)。數(shù)據(jù)顯示截至2月11日，已有1 716名醫(yī)務(wù)人員確診2019-nCoV肺炎，并導(dǎo)致5名醫(yī)務(wù)人員死亡[11]。如何減少醫(yī)源性感染是我們面臨的一個(gè)重要課題。若對患者血標(biāo)本進(jìn)行病毒滅活處理，再對滅活后的血標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，能夠有效減少實(shí)驗(yàn)室工作人員與病毒的接觸，降低醫(yī)源性感染的發(fā)生。本研究對乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)、人類免疫缺陷病毒抗體(抗-HIV)、梅毒螺旋體抗體(抗-TP)、乙型肝炎病毒(HBV) DNA和丙型肝炎病毒(HCV) RNA陽性血清和全血標(biāo)本進(jìn)行56℃加熱30 min滅活病毒處理，分析滅活前后HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、HBV DNA和HCV RNA水平的差異，為特殊情況下減少實(shí)驗(yàn)室工作人員醫(yī)源性感染提供參考經(jīng)驗(yàn)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集57份陽性血清標(biāo)本，其中HBsAg陽性、抗-HCV陽性、抗-HIV陽性和抗-TP陽性標(biāo)本各10份，HBV DNA陽性標(biāo)本9份，HCV RNA陽性標(biāo)本8份；收集38份用分離膠促凝管采集的陽性全血標(biāo)本，其中HBsAg陽性、抗-HCV陽性和抗-TP陽性標(biāo)本各10份，HBV DNA陽性標(biāo)本8份。

1.2 研究方法 血清標(biāo)本直接放入56℃水浴箱加熱30 min滅活病毒；全血標(biāo)本首先3 000 r/min離心10 min，不分離血清，直接將標(biāo)本放入56℃水浴箱加熱30 min滅活病毒。采用美國雅培公司HBsAg定量測定試劑盒、HCV抗體測定試劑盒、HIV抗原及抗體聯(lián)合測定試劑盒和TP抗體測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法)分別檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP；采用圣湘生物公司HBV核酸檢測試劑盒和HCV核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)測定HBV DNA和HCV RNA，比較熱滅活前后各指標(biāo)檢測水平的差異，并分析滅活前后兩者的一致性。HBsAg以IU/mL表示，抗-HCV、抗-HIV和抗-TP結(jié)果以S/CO值表示，HBV DNA和HCV RNA結(jié)果以循環(huán)閾值(Ct)表示。

1.3 儀器 雅培全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀i2000SR(美國)，恒溫水浴箱(中國上海)，宏石PCR儀SLAN-96P(中國上海)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)的比較采用配對t檢驗(yàn)。以滅活后與滅活前的差值作縱軸，滅活后與滅活前的均值作橫軸，作Bland-Altman圖分析滅活前后的一致性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清標(biāo)本滅活對輸血相關(guān)感染標(biāo)志物檢測的影響 血清標(biāo)本56℃加熱30 min滅活前后HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、HBV DNA和HCV RNA的結(jié)果如圖1所示，采用配對t檢驗(yàn)，熱滅活前后每個(gè)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Bland-Altman圖分析見表1和圖2，所有的點(diǎn)均位于95%LoA上限與下限之間，符合至少95%的點(diǎn)在95%LoA范圍內(nèi)，表明血清滅活前后輸血相關(guān)感染標(biāo)志物的水平一致性較好。

A—F為血清標(biāo)本，G—J為全血標(biāo)本。

表1 輸血相關(guān)感染標(biāo)志物熱滅活前后Bland-Altman圖參數(shù)

Table 1 Parameters of Bland-Altman diagram of blood transfusion-related infection markers before and after heat inactivation

項(xiàng)目標(biāo)本例數(shù)滅活前后差值均數(shù)差值標(biāo)準(zhǔn)差95%LoA范圍HBsAg血清102.7153.891(-4.912, 10.342)抗-HCV血清10-0.3420.891(-2.088, 1.404)抗-HIV血清106.73112.393(-17.559, 31.020)抗-TP血清10-0.1480.364(-0.862, 0.566)HBV DNA血清9-0.0040.140(-0.279, 0.270)HCV RNA血清80.6901.358(-1.972, 3.352)HBsAg全血101.2431.894(-2.470, 4.956)抗-HCV全血10-0.1330.302(-0.725, 0.459)抗-TP全血100.0900.168(-0.239, 0.419)HBV DNA全血8-0.6191.242(-3.054, 1.816)

2.2 全血標(biāo)本滅活對輸血相關(guān)感染標(biāo)志物檢測的影響 全血標(biāo)本56℃加熱30 min滅活前后HBsAg、抗-HCV、抗-TP和HBV DNA的結(jié)果如圖1所示，采用配對t檢驗(yàn)，熱滅活前后每個(gè)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Bland-Altman圖分析見表1和圖3，所有的點(diǎn)均位于95%LoA上限與下限之間，符合至少95%的點(diǎn)在95%LoA范圍內(nèi)，表明全血滅活前后輸血相關(guān)感染標(biāo)志物的水平一致性較好。

“----”線從上至下依次為95%LoA上限、差值平均值和95%LoA下限。

“----”線從上至下依次為95%LoA上限、差值平均值和95%LoA下限。

3 討論

國家衛(wèi)生健康委員會(huì)將2019-nCoV肺炎納入法定傳染病乙類管理，但采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施。有報(bào)道表明，2019-nCoV比SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)更具有傳染性[12-13]。為減少臨床實(shí)驗(yàn)室醫(yī)源性感染的發(fā)生，本研究對血清和全血標(biāo)本加熱滅活病毒，分析滅活前后輸血相關(guān)感染標(biāo)志物水平的差異，結(jié)果表明56℃加熱30 min滅活血清標(biāo)本，檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、HBV DNA和HCV RNA，結(jié)果與滅活前無差異；56℃ 30 min滅活全血標(biāo)本，檢測 HBsAg、抗-HCV、抗-TP和HBV DNA，結(jié)果與滅活前無差異，滅活前后具有較好的一致性。該熱滅活的方法操作簡單，僅需56℃恒溫水浴箱，可考慮作為一種減少實(shí)驗(yàn)室工作人員醫(yī)源性感染的方法。

類似研究[14-15]采用血清標(biāo)本進(jìn)行熱滅活，但實(shí)踐中分離2019-nCoV肺炎患者血清或血漿的操作有暴露的風(fēng)險(xiǎn)，故設(shè)計(jì)不分離患者血清，而直接采用全血進(jìn)行56℃熱滅活的方法。全血熱滅活時(shí)血標(biāo)本內(nèi)紅細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重溶血，釋放血紅蛋白和細(xì)胞碎片，干擾試驗(yàn)結(jié)果[16-18]，故選用帶分離膠的促凝管采集全血。血液分離膠是一種黏性流體，將標(biāo)本離心后，分離膠在血清和細(xì)胞之間形成隔離層，該隔離層可以牢固的黏附在采血管內(nèi)壁，阻止血清層與細(xì)胞層間的相互擴(kuò)散[19-20]。在分離膠的作用下，56℃熱滅活造成的細(xì)胞溶血基本對試驗(yàn)結(jié)果沒有干擾。本組試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，熱滅活全血標(biāo)本不會(huì)影響HBsAg、抗-HCV、抗-TP和HBV DNA的檢測結(jié)果。相比于滅活血清標(biāo)本，滅活全血標(biāo)本操作更簡單，而且減少了實(shí)驗(yàn)室工作人員暴露的風(fēng)險(xiǎn)，可考慮作為實(shí)驗(yàn)室工作人員防止醫(yī)源性感染的首選方法。

開展輸血相關(guān)感染標(biāo)志物檢測不僅能夠區(qū)分患者是否為輸血后感染經(jīng)血傳播疾病，還可以發(fā)現(xiàn)潛在的傳染源,有助于醫(yī)務(wù)人員加強(qiáng)操作隔離防護(hù)[21]。在疫情期間，疑似或者確診2019-nCoV感染患者需要檢測輸血相關(guān)感染性標(biāo)志物，建議采用含分離膠的促凝管收集全血標(biāo)本。血液凝固后離心，停止后等待不少于15 min，待氣溶膠自然沉降下來后打開離心機(jī)蓋，用75%乙醇噴霧消毒[22]。取出后不分離血清直接將全血56℃熱滅活30 min，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。這樣能夠在病毒被滅活前最大程度減少實(shí)驗(yàn)室工作人員的暴露，減少醫(yī)源性感染的發(fā)生[23]。實(shí)際上，在2019-nCoV肺炎流行的時(shí)候，本院輸血科一直采用熱滅活的方法處理疑似或確診患者的輸血相關(guān)感染標(biāo)志物標(biāo)本,但由于其檢測結(jié)果均為陰性，所以未納入本研究。本研究還存在一些局限，新冠肺炎疫情發(fā)生后，一方面全國各地采取了交通管制、限制人員流動(dòng)等管控措施；另一方面醫(yī)院暫停了門診和擇期手術(shù)。導(dǎo)致未收集到抗-HIV、HCV RNA和HIV RNA陽性的全血標(biāo)本及HIV RNA陽性的血清標(biāo)本，需要在以后繼續(xù)收集樣本。核酸具有良好的熱穩(wěn)定性，56℃熱滅活后，病毒的酶活性、結(jié)構(gòu)蛋白和膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，失去復(fù)制能力，但是通過PCR的方法還能夠檢測到核酸物質(zhì)[24]。結(jié)合前面的試驗(yàn)結(jié)果，可以推測熱滅活的方法也同樣適用于HIV RNA和全血HCV RNA的檢測，文獻(xiàn)[24-26]結(jié)果與此推測一致。此外，該方法有一定的限制性，如針對紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目、血清酶學(xué)、凝血功能和補(bǔ)體檢測不適合做熱滅活，其他的實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目則需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。