費笑非，杜芳，張紅鴨，石曉丹，張赟，燕江云，趙鋼

隱球菌病是晚期HIV陽性患者最重要的機會性感染之一，其最常見的臨床表現(xiàn)是隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis，CM)[1]，發(fā)病率和病死率較高。在發(fā)達國家，大部分CM患者與HIV感染相關[2]。但在我國及其他亞洲國家，一半以上的CM患者免疫功能正常[3]。研究認為，這些“免疫功能正?！钡腃M患者可能存在影響免疫功能的潛在疾病[4]。在發(fā)達國家，HIV陰性沒有接受器官移植的CM患者是死亡率最高的人群[5]。與HIV陽性患者相比，這一人群的診斷往往較晚，因此早期診斷是影響CM預后的一個關鍵因素。

CM的傳統(tǒng)檢測方法包括腦脊液墨汁染色涂片和腦脊液隱球菌培養(yǎng)[3]。腦脊液隱球菌培養(yǎng)是診斷CM的“金標準”，但通常需要幾天時間[6]。隱球菌莢膜抗原可在血清、腦脊液和尿液標本中檢測到。方法包括乳膠凝集法(latex agglutination，LA)、酶免疫法(enzyme immunoassays，EIAs)和膠體金免疫層析法(lateral flow assay，LFA)[7]。LFA敏感度和特異度最高，且成本低，速度快，已廣泛應用[4]。但是人體清除莢膜多糖抗原相對較慢，即使患者腦脊液多次隱球菌涂片和培養(yǎng)變?yōu)殛幮院螅乖瓩z測仍可陽性，所以抗原檢測是否轉陰不能作為CM停藥的標準[3]。與常規(guī)方法相比，分子生物學方法不僅可以診斷CM，還具有其他價值[8]。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一種很有潛力的病原體檢測方法，一次檢測可以識別一系列潛在的病因——病毒、細菌、真菌和寄生蟲。目前，該方法已經(jīng)應用于隱球菌性腦膜炎的臨床檢測[9]。本研究旨在比較腦脊液墨汁染色、腦脊液隱球菌培養(yǎng)、LFA和mNGS等方法診斷CM的價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2018年11月西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科腦脊液細胞學檢查室CM患者腦脊液樣本47份為病例組，患者符合以下隱球菌腦膜炎診斷標準[3]：(1)有發(fā)熱、頭痛、腦膜刺激征等腦膜炎癥狀和體征，腦脊液細胞學、生化檢查異常；(2)腦脊液墨汁染色和/或培養(yǎng)陽性。對照組為同期非CM患者腦脊液樣本40份，患者符合細菌性腦膜炎、病毒性腦炎、結核性腦膜炎和自身免疫性腦炎的診斷標準[10-13]。樣本均保存在-80℃冰箱中。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 隱球菌檢測方法

1.2.1 腦脊液墨汁染色：將腦脊液標本離心，除去上清，沉淀物涂于干凈玻片上，以墨汁染色。若在黑色背景中觀察到如細胞大小且透光的物體，周圍呈明亮區(qū)域，表現(xiàn)為典型的“星夜”現(xiàn)象，為陽性結果。

1.2.2 腦脊液隱球菌培養(yǎng)：用無菌方法將少量腦脊液接種于沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周，有菌生長即為陽性。

1.2.3 LFA檢測：將腦脊液樣本離心，取上清40 μl加入試管中，滴入標本稀釋液1滴，隨后將膠體金試紙條放入試管中，室溫孵育10 min后讀取結果。試劑條包含檢測條帶和對照條帶。2個條帶都顯示為陽性結果，僅顯示對照條帶為陰性結果。

1.2.4 mNGS檢測：(1)DNA提取。提取腦脊液300 μl，使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的微量樣品基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Micro DNA Kit，DP316)，按照說明書操作提取DNA。使用無腦脊液樣本的無菌水作為陰性對照。(2)建庫及測序。用Bioruptor Pico非接觸式超聲波破碎儀將提取的DNA變成200～300 bp長度的片段。添加末端修復接頭，用PCR技術擴增DNA，構建文庫。根據(jù)MiniSeq系統(tǒng)文庫變性和稀釋指南，按照稀釋、混合、變性、再稀釋、混合測序參考物PhiX(相當于DNA總量的1%)的步驟純化文庫。使用Illumina公司的MiniSeq測序儀進行高通量測序。(3)數(shù)據(jù)分析。按照Burrows-Wheeler Alignment tool (BWA)[14]算法，用計算機減去測序結果中的人源序列，將剩余的數(shù)據(jù)與微生物基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，該數(shù)據(jù)庫由2 700個病毒、1 494個細菌、73個真菌和48個與人類相關的寄生蟲基因組組成。并使用Soap coverage進一步處理數(shù)據(jù)，計算每個物種特異性序列數(shù)和基因覆蓋度及對應的測序深度。

2 結 果

2.1 2組一般資料比較 病例組CM腦脊液樣本47份來自CM患者42例，其中男26例(61.90%)，女16例(38.10%)，年齡17～88(47.5±18.6)歲?；A疾病22例(52.38%)：HIV陽性6例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例，結締組織病3例，疑似“自身免疫性腦炎”口服激素2例，慢性腎炎2例，腎病綜合征3例，腎移植1例，2型糖尿病4例。47份腦脊液樣本平均存放時間69～1 197 d，中位數(shù)420 d，其中未使用抗真菌藥物樣本29份(61.70%)，使用抗真菌藥物樣本18份(38.30%)。對照組40份樣本分別來自細菌性腦膜炎患者7例，病毒性腦炎患者9例，結核性腦膜炎患者14例和自身免疫性腦炎患者10例，其中男20例(50.00%)，女20例(50.00%)，年齡15～74(36.8±13.8)歲。

2.2 隱球菌檢測結果

2.2.1 2組墨汁染色、LFA、隱球菌培養(yǎng)結果比較：病例組樣本47份均行墨汁染色和LFA檢測，其中29份樣本進行腦脊液隱球菌培養(yǎng)檢測，結果為墨汁染色陽性24份，陰性23份；LFA陽性42份，陰性5份；隱球菌培養(yǎng)陽性23份，陰性6份。對照組樣本40份均行墨汁染色和LFA檢測，其中26份樣本進行腦脊液培養(yǎng)檢測，結果為墨汁染色和培養(yǎng)檢測結果均為陰性，LFA陽性1份，陰性39份；腦脊液培養(yǎng)均陰性。見表1。

2.2.2 2組mNGS檢測結果比較： 病例組腦脊液樣本47份中，有39份mNGS檢測到隱球菌特異性序列數(shù)(unique reads >0)。unique reads的范圍為2～124 168，基因覆蓋度范圍為0.000 79%～31.071 1%。此外，mNGS還檢測到曲霉菌1例，細菌9例和病毒4例。對照組40份樣本中，有3份mNGS檢測到隱球菌特異性序列數(shù)(unique reads=2)，基因覆蓋度范圍為0.000 82%～0.001 22%。測序深度為1。

NGS的結果受實驗環(huán)境和測序試劑的影響，因此目前全世界范圍內(nèi)尚無統(tǒng)一的陽性標準，也沒有特定的NGS診斷CM的陽性標準。根據(jù)真菌在DNA提取中該物種的基因覆蓋度比同時檢測到的其他任何真菌高出5倍的該標準[15]，病例組樣本陽性35份，陰性12份；對照組40份樣本均為陰性，見表1。

2.3 病例組未用藥樣本與用藥樣本陽性率比較 未使用抗真菌藥物腦脊液樣本29份均行墨汁染色、LFA和mNGS檢測，行腦脊液隱球菌培養(yǎng)檢測樣本22份；使用抗真菌藥物腦脊液樣本18份均行墨汁染色、LFA和mNGS檢測，行腦脊液培養(yǎng)隱球菌檢測樣本7份。未用藥與用藥腦脊液樣本比較，mNGS和隱球菌培養(yǎng)的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他檢測方法的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4 4種檢測方法的方法學指標比較 墨汁染色的敏感度、陰性預測值最高和準確度最低，LFA的敏感度、陰性預測值和準確度最高，4種檢測方法的特異度和陽性預測值均接近100%，見表3。墨汁染色的敏感度和準確度與其他3種檢測方法比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他檢測方法間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，僅墨汁染色與LFA的陰性預測值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他檢測方法間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。4種檢測方法的特異度和陽性預測值，根據(jù)Fisher確切概率法計算，相互之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 病例組未用藥與用藥樣本4種檢測方法陽性率比較 [%(n/n)]

3 討 論

腦脊液墨汁染色涂片是目前CM的主要診斷方法之一，該方法操作簡單，耗時較短，但受墨汁質(zhì)量、操作者經(jīng)驗與技術水平等影響，即使采用離心濃縮腦脊液的方法，敏感度也不高[7, 16]。國內(nèi)墨汁染色的敏感度為40.00%～66.67%[17-19]，低于國外報道的80.00%～93.60%，這可能與HIV陰性患者腦脊液中隱球菌量較少有關[20-23]。本研究的敏感度也較低，與國內(nèi)相似。該方法所需物資設備較簡單，特別適合于資源有限的地區(qū)，但其敏感度在所有方法中最低，建議臨床使用墨汁染色方法時聯(lián)合其他方法。

腦脊液LFA檢測具有較高的敏感度和特異度，是診斷CM最敏感的方法。該方法可檢測血液、腦脊液、尿液中的隱球菌抗原，且僅耗時10 min[16]。但CM患者血液和腦脊液中的莢膜抗原可能在數(shù)月至數(shù)年后仍保持陽性，因此LFA無法監(jiān)測治療的效果，更無法作為停藥的標準[22]。本研究中LFA的敏感度為89.36%，略低于之前報道的95.00%～100%[20-22]。但在所有方法中敏感度最高，且成本低，速度快，所需腦脊液量較少(40 μl)，建議臨床診斷CM時首選LFA檢測。

表3 4種檢測方法的方法學指標比較 [%(n/n)]

表4 4種檢測方法的敏感度、陰性預測值和準確度比較

腦脊液培養(yǎng)是診斷CM的金標準，但確診需要數(shù)天時間，最終結果可能需要1～2周。因此，使用其他診斷方法來加快診斷和治療[24]。但CM患者腦脊液LFA和墨汁染色可長期陽性，對治療效果沒有參考價值，目前腦脊液培養(yǎng)陽性是確認CM復發(fā)或治療失敗的惟一檢測方法[22]。本研究腦脊液培養(yǎng)的敏感度為79.31%，高于國內(nèi)其他研究報道的25.00%～60.00%[16-17, 25]，低于國外HIV陽性患者90.00%～95.70%[20, 22, 24]。但未使用抗真菌藥物標本敏感度遠高于使用抗真菌藥物標本(P<0.01)。該結果表明，抗真菌藥物對腦脊液隱球菌培養(yǎng)的敏感度有顯著影響。建議臨床懷疑CM的患者在使用抗真菌藥物前行腦脊液隱球菌培養(yǎng)，且判斷CM復發(fā)或治療失敗時需進行腦脊液培養(yǎng)。

mNGS是一種無偏倚的非靶向檢測方法，目前已應用于臨床腦脊液病原體的檢測，其優(yōu)點為在腦脊液樣本量有限時，可在一次試驗中檢測出多個潛在的病原體，還可以檢測或排除合并感染，尤其對于免疫功能受損的患者有益[26]。本研究中，mNGS不僅檢測到隱球菌，還檢測到其他病原體。但mNGS目前尚無較大樣本量的CM臨床檢測研究，且無統(tǒng)一的陽性閾值，本研究按照國內(nèi)相關報道的閾值標準確定mNGS的敏感度。mNGS的敏感度低于LFA和腦脊液培養(yǎng)，可能有以下原因：(1)文獻報道，腦脊液樣本存放時間較長，經(jīng)歷多次凍融循環(huán)和使用抗真菌藥物可能會降低mNGS的敏感度[26]。本研究病例組樣本平均存放時間較長，且未使用抗真菌藥物標本敏感度高于使用抗真菌藥物標本(P<0.05)。(2)Schlaberg等[27]的研究提出，臨床為減少mNGS假陽性，故意設定保守的閾值，應該為臨床明確的病原體設立比臨床意義不明且環(huán)境中存在的病原體更寬松的報告閾值[26]。按照目前的閾值標準，敏感度較為保守。因此，當患者有免疫功能受損或腦脊液樣本有限時，建議臨床在使用抗真菌藥物前及時進行mNGS檢測。

本研究有一定的局限性：(1)為回顧性研究，腦脊液樣本凍存時間較長，影響mNGS結果的準確性。(2)雖然比較了傳統(tǒng)方法和mNGS檢測CM臨床腦脊液本的敏感度和特異度，但樣本量較少，且目前的閾值較保守，需用大樣本前瞻性的研究，進一步探究mNGS檢測的截斷值、敏感度和特異度。(3)mNGS對抗真菌藥物較為敏感，需用大樣本前瞻性的研究，進一步判斷mNGS是否可用于監(jiān)測CM的治療效果和判斷CM復發(fā)或治療失敗。

綜上所述，LFA的敏感度最高，建議臨床首選；墨汁染色操作簡單但敏感度較低，需與其他方法聯(lián)合使用；隱球菌培養(yǎng)和mNGS對抗真菌藥物敏感，需在使用抗真菌藥物前進行檢測。mNGS是一種較為敏感的檢測病原體的方法，可用于CM的早期診斷，還可以檢測或排除合并感染。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

費笑非、趙鋼：設計研究方案，實施研究過程，設計論文框架，撰寫論文；杜芳：提出研究思路，指導研究設計；張紅鴨、石曉丹：進行文獻調(diào)研與整理，修訂論文、論文審核；張赟、燕江云：數(shù)據(jù)收集，分析整理