吳日釗 霍景山 劉海燕 張偉霞 鐘婉婷

1.廣東省佛山健翔醫(yī)院普通外科，廣東佛山 528000；2.廣東省佛山市中醫(yī)院外一科，廣東佛山 528000；3.廣東省佛山健翔醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000；4.廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000

富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是近年熱門探討的生物療法技術(shù)，是通過離心全血而獲得的含有高濃度血小板的血漿，將其與凝血酶-鈣劑按比例混合可制成血小板凝膠[1]（platelet gel，PG）。高濃度血小板激活后可釋放大量生長因子[2]，目前主要用于慢性創(chuàng)面修復(fù)[3]、骨與軟組織再生[4]、整形美容方面[5]的研究。筆者臨床用PRP 制成PG 修復(fù)反復(fù)感染的難治性慢性創(chuàng)面時(shí)，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面感染狀況改善，思考PRP 具有抑菌作用。故筆者擬通過PRP 對(duì)慢性創(chuàng)面常見的難治的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究，為進(jìn)一步探討PRP 治療慢性創(chuàng)面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與試劑 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（邁瑞5380），數(shù)顯恒溫水浴箱（金壇科析HHW600），全自動(dòng)洗滌離心機(jī)（上海耐圣卡蘭 XTL-417W），一次性無菌真空采血管（蘇州康?。?zhǔn)媳葷醿x（北京中瑞祥ZRX-29417），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北納生物），PBS 磷酸緩沖鹽溶液（海標(biāo)科技1000mL）。

1.1.2 菌株 標(biāo)準(zhǔn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株 （MRSA，ATCC 43300）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)公司。

1.2 研究對(duì)象

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過。2019年3 ～8 月在廣東省佛山市內(nèi)征集24 例健康志愿者，男12 例，女12 例，年齡20 ～35 歲，平均（26.1±4.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）志愿者知情同意并簽署倫理同意書；（2）3 個(gè)月內(nèi)未使用抗生素；（3）實(shí)驗(yàn)2 周內(nèi)血常規(guī)：白細(xì)胞（4.0 ～10.0）×109/L，血小板（100 ～300）×109/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重心肝腎功能障礙；（2）合并血液系統(tǒng)相關(guān)疾病。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PRP、PPP 與PG 的制備 每位志愿者均抽取外周靜脈血25mL。全血經(jīng)兩次差速離心獲得PRP與PPP（platelet-poor plasma，貧血小板血漿），兩次離心的條件[6]分別為：20℃，1500r/min、時(shí)間10min和3200r/min、時(shí)間8min。將凝血酶凍干粉溶于10% CaCl2制成終濃度1000U/mL 凝血酶-CaCl2激活劑，與PRP 以1 ∶10 混合制成PG。

1.3.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 轉(zhuǎn)菌 本實(shí)驗(yàn)在佛山市中醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格無菌下進(jìn)行。MRSA 菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37.0℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

1.3.2.2 配管 將1mL 菌株接種至含4mL PBS 的無菌試管中，充分混懸。以0.5 麥?zhǔn)蠁挝槐葷嶂陆K濃度為1.0×106cfu/mL，取5 支無菌干燥試管注入0.1mL 菌液。分別取制備的PRP、PPP、PG 及全血、PBS 注入此5 支試管內(nèi)，并以注入的成分命名分組。PRP 組注入0.5mL PRP 和0.4mL PBS，PPP 組注入0.5mL PPP 和0.4mL PBS，PG 組加入0.55mL PG 和0.35mL PBS，全血組加入0.5mL 含抗凝劑全血和0.4mL PBS，PBS 組（對(duì)照組）加入0.9mL PBS。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）用血細(xì)胞分析儀檢測PRP、PPP 及全血的白細(xì)胞、血小板含量。（2）菌落計(jì)數(shù)：五組試管置入37℃恒溫箱中孵育，間隔0、2、4、6、8、12、24h 分別 取0.1mL 樣 本，用0.9mL PBS 做3 次l ∶10 系列稀釋，取100μL 樣本點(diǎn)種于血瓊脂平板后，置37.0℃恒溫箱培養(yǎng)24h，最后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。所獲數(shù)據(jù)用時(shí)間-菌落濃度曲線圖表示。（3）抑菌率。抑菌率[7]＝（對(duì)照組平均菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)）/對(duì)照組平均菌落數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示；由于菌落計(jì)數(shù)不成正態(tài)分布，因此取其對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化使之基本符合正態(tài)分布。白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)、抑菌率的組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P ＜0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞及血小板含量計(jì)數(shù)

全血中白細(xì)胞與血小板含量計(jì)數(shù)分別為（6.642±1.288）×109/L 和（183.816±43.004）×109/L。所得的PRP 中分別為（16.018±3.224）×109/L 和（1013.142±155.822）×109/L，與全血比較白細(xì)胞含量計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；所 得 的PPP 中 分 別 為（0.416±0.208）×109/L 和（19.223±4.038）×109/L，與全血比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表1。

2.2 各組各時(shí)間點(diǎn)的MRSA菌落計(jì)數(shù)

各組在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MRSA 的菌落濃度計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1 所示。培育開始階段，PRP 組、PG 組的菌落

表1 二次離心后取PRP、PPP及全血的白細(xì)胞、血小板含量（，×109/L）

表1 二次離心后取PRP、PPP及全血的白細(xì)胞、血小板含量（，×109/L）

白細(xì)胞含量 血小板含量組別PRP組 PPP組 PRP組 PPP組PRP/PPP組 16.018±3.224 0.416±0.208 1013.142±155.822 19.223±4.038全血組 6.642±1.288 183.816±43.004 t 18.112 22.524 25.104 18.724 P ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 PRP組與PG組在不同時(shí)間對(duì)MRSA的抑菌率比較，%）

表2 PRP組與PG組在不同時(shí)間對(duì)MRSA的抑菌率比較，%）

組別 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P PRP組 14.493±1.813 29.630±4.587 25.882±2.787 15.294±1.508 12.791±4.192 7.865±3.821 149.780 ＜0.01 PG組 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 9.532 8.842 7.449 5.679 1.890 1.922 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

表3 PPP組與PG組在不同時(shí)間對(duì)MRSA的抑菌率比較，%）

表3 PPP組與PG組在不同時(shí)間對(duì)MRSA的抑菌率比較，%）

組別 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P PPP組 5.797±1.432 2.469±0.754 4.706±0.622 2.353±0.338 2.326±0.527 1.124±0.435 122.898 ＜0.01 PG組 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 17.296 26.438 24.029 17.119 11.547 7.286 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 全血組與PG組在不同時(shí)間對(duì)MRSA的抑菌率比較，%）

表4 全血組與PG組在不同時(shí)間對(duì)MRSA的抑菌率比較，%）

組別 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P全血組 7.246±1.225 16.049±2.724 17.647±1.912 9.412±1.688 3.488±1.323 3.371±1.128 293.568 ＜0.01 PG組 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 16.335 15.483 13.634 10.253 9.959 5.538 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

濃度呈現(xiàn)呈現(xiàn)先下降后上述趨勢，至4h 達(dá)到最低點(diǎn)，此時(shí)間點(diǎn)的菌落計(jì)數(shù)最少，抗菌效果最明顯，隨后菌落濃度開始上升，兩組組均至12h 后菌落濃度上升趨勢進(jìn)入相對(duì)平穩(wěn)期。PPP 組與PBS 組的菌落濃度在培育開始階段即呈對(duì)數(shù)上升趨勢，全血組成緩慢上升趨勢，此三組菌落濃度同樣于12h 后趨向于平穩(wěn)。上述說明菌落計(jì)數(shù)有隨時(shí)間變化趨勢呈負(fù)相關(guān)。含有高濃度血小板的組別（PRP 組、PG 組）的菌落計(jì)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均低于另外三個(gè)組別（全血組、PPP 組、PBS 組），即含有高濃度PRP 組具有抗菌性。且PG 組與PRP 組的對(duì)比中，12h 內(nèi)PG 的抗菌性優(yōu)于PRP，12h 后PG 組與PRP 組細(xì)菌生長趨向穩(wěn)定。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MRSA 的菌落濃度曲線圖

2.3 各組對(duì)MRSA的抑菌率

含 有 高 濃 度PRP 的 組 別（PG 組、PRP 組）對(duì)MRSA 的 抑 菌 率 在12h 內(nèi) 明 顯，并 在4h 時(shí)抑菌率最強(qiáng)；其中PG 組平均抑菌率達(dá)到了（41.975±5.121）%，與PRP 組的（29.630±4.587）%比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），與其他三組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。4h后含有高濃度PRP 的兩組的抑菌率均逐漸降到最低狀態(tài)。含有高濃度PRP 的PG 組、PRP 組的抑菌作用始終依次高于全血組、PPP 組，并在12h 內(nèi)抑菌率差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2 ～4。

3 討論

基于富血小板血漿（PRP）含有多種高濃度的生長因子，近年國內(nèi)將此生物療法技術(shù)廣泛應(yīng)用于普通外科、骨科、燒傷整形科等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域。隨著應(yīng)用的開展，漸多的文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]PRP 可能具有抑菌活性，這與筆者臨床應(yīng)用PRP 修復(fù)慢性創(chuàng)面的臨床觀察結(jié)果一致。

筆者觀察到在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，PRP 的血小板含量約為全血的5.5 倍，白細(xì)胞含量為全血的2.4 倍，理論上是有一定的抑菌作用的，同時(shí)抑菌率數(shù)據(jù)顯示其與血小板濃度呈正相關(guān)性。白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，是已被確認(rèn)的在人防御機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。白細(xì)胞在PRP 的制備過程中大部分沒有被破壞，其重要的抗病原體活性得以保持[10]。髓過氧化酶（MPO）存在于中心粒細(xì)胞中，其被病原體等激活和脫顆粒后，生成具有高度殺菌活性的次氯酸和活性氧衍生物，對(duì)病原體進(jìn)行殺傷；同時(shí)中心粒細(xì)胞內(nèi)為含有多種水解酶的溶酶體，具有消化病原體及異物的作用。單核細(xì)胞進(jìn)入組織后轉(zhuǎn)化為可以吞噬致病物質(zhì)的巨噬細(xì)胞，并催化產(chǎn)生活性氧代謝物，殺滅病原體[11]。而淋巴細(xì)胞則通過免疫應(yīng)答作用來發(fā)揮抑菌作用。血小板是PRP 中含量最豐富的細(xì)胞成分，早在1992年Yeaman 等[12]就發(fā)現(xiàn)它具備抑菌活性，報(bào)道顯示血小板可在體外直接黏附和清除細(xì)菌、真菌，同樣也能增強(qiáng)血液中病原微生物的清除率。另一研究發(fā)現(xiàn)[13]，血小板激活后除了可釋放大量生長因子加速軟組織修復(fù)外，同時(shí)具有與中性粒細(xì)胞等共同的結(jié)構(gòu)和功能，如lgG 的Fe 受體、CD36 抗原等受體。激活后的血小板，其表面的受體能促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)病原體的內(nèi)化作用；血小板亦可產(chǎn)生過氧化物、羥基自由基和過氧化氫等抑菌氧化代謝產(chǎn)物，直接黏附和內(nèi)化病原體。血小板裂解后能釋放有效的抗菌肽，大多數(shù)研究認(rèn)為抗菌肽是血小板的主要抗菌因子，具有直接抗菌作用。Tang 等[14]證實(shí)了這一點(diǎn)，其研究顯示血小板激活后可釋放7 中抗菌肽，并表明其具有直接的抗菌特性。另外，血小板堿性蛋白已被證實(shí)除了作為CXC 趨化因子的信號(hào)作用，還有對(duì)抗病原體的作用[11]?；赑RP 的抑菌活性，學(xué)者開始探討PRP 對(duì)病原菌的抑菌實(shí)驗(yàn)作用。趙連前等[15]報(bào)道了不同血小板濃度的富血小板凝膠具有抑制金黃色葡萄球菌的作用。

筆者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察到含有高濃度PRP的PG 組、PRP 組的菌落計(jì)數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均低于另外三個(gè)組別，發(fā)現(xiàn)PRP 的抑菌作用隨血小板的濃度增加而增加，可能由于抗菌肽的釋放越多，抑菌作用越強(qiáng)，這說明PRP 抑菌作用具有濃度依賴性。PG 組、PRP 組對(duì)MRSA 的抑菌作用在12h 內(nèi)明顯，并以第4h 最強(qiáng)，12h 后逐漸減弱，可能由于抗菌肽的消耗，抑菌作用減弱，細(xì)菌呈現(xiàn)對(duì)數(shù)繁殖，這表明PRP 抑菌作用具有時(shí)效性。筆者另觀察到，PG 組的菌落計(jì)數(shù)亦低于高于PRP 組，考慮PRP 組中的未加入凝血酶，抑菌成分未完全釋放，故在本實(shí)驗(yàn)中抑菌作用較PG 低。PPP 組僅含有極少量的血小板與白細(xì)胞，故其與對(duì)照組（PBS 組）相仿，基本不呈現(xiàn)抑菌活性。全血組中的白細(xì)胞與血小板量介于PRP 組與PPP 組之間，考慮白細(xì)胞作用與血小板釋放一定量的抑菌成分相關(guān)，菌落濃度曲線圖結(jié)果呈現(xiàn)符合此中界結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)有關(guān)PRP 的抑菌作用、時(shí)效性的結(jié)果與筆者臨床中運(yùn)用PRP/PG 修復(fù)慢性創(chuàng)面的臨床觀察結(jié)果基本吻合。筆者臨床中觀察中慢性褥瘡創(chuàng)面運(yùn)用PRP/PG 除了其創(chuàng)面體積明顯縮小以外，使用PRP/PG 的24h 內(nèi)創(chuàng)面周圍紅腫熱癥狀較術(shù)前改善，且整個(gè)治療周期中，創(chuàng)面滲出量、滲出液性質(zhì)均較未使用PRP 時(shí)期好轉(zhuǎn)，故筆者在實(shí)際病例中減少了使用抗菌藥物輔助治療。由此，筆者進(jìn)一步認(rèn)為在慢性創(chuàng)面中PRP 與使用抗菌藥物相比更具優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在以下5 個(gè)方面：（1）PRP 在促進(jìn)組織修復(fù)的過程中發(fā)揮的抑菌作用，這均屬于PRP 的自身功能，兩者可能存在協(xié)同的作用；（2）PRP 發(fā)揮抑菌作用的機(jī)制有別于抗菌藥物，故病原微生物產(chǎn)生耐藥性的可能性極低；（3）基于PRP 具有抑菌作用，可探討減少使用抗菌藥物的時(shí)長、劑量，甚至降級(jí)使用抗菌藥物的可能性；（4）PRP 在創(chuàng)面形成PG 黏附于創(chuàng)面表面，可一定程度上阻礙病原微生物進(jìn)入創(chuàng)面，減少病原微生物的新增量；（5）PRP 源于自身血液提取獲得，可避免過敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)及傳染性疾病的發(fā)生。

目前，PRP 主要用于軟組織的修復(fù)方面，隨著更多研究抑菌作用的證實(shí)，其也逐漸用于感染創(chuàng)面的處理，張宏亮等[16]報(bào)道PRP 與NPWT 聯(lián)合應(yīng)用于難治性感染創(chuàng)面具有較好的抑菌效果，能夠提高機(jī)體EPO 水平，促進(jìn)傷口愈合。由此，筆者認(rèn)為可進(jìn)一步探討PRP 的抑菌作用作為傳統(tǒng)使用抗菌藥物的一種有效補(bǔ)充，作為預(yù)防和治療例如關(guān)節(jié)感染、慢性創(chuàng)面感染等PRP 治療領(lǐng)域的一種補(bǔ)充手段。但由于時(shí)間及條件的限制，本實(shí)驗(yàn)研究仍存在一定的不足之處，如本實(shí)驗(yàn)對(duì)象是健康人群、使用的是外購的MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株，與合并多種慢性疾病的人群、與臨床分離菌株、創(chuàng)面多種菌群存在的復(fù)雜情況存在差異，下一步筆者將選取臨床患者或更多的菌群進(jìn)一步探討PRP 的抑菌作用及臨床應(yīng)用來加以佐證。