婁天宇，李瑞吉，劉金輝，于尚玥，王志斌

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029)

丹參注射液是由丹參飲片經(jīng)過水提醇沉等步驟制備而成的注射液，具有保護(hù)心腦血管、抗血小板聚集、抗菌、抗炎等藥理作用[1,2]，臨床上廣泛用于治療冠心病、心悸胸悶、心絞痛[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參飲片中的主要藥效成分水溶性酚類在注射液制備過程中易損失[4]，導(dǎo)致不同廠家不同批次的丹參注射液質(zhì)量存在差異。因此，當(dāng)下亟待有綜合、整體、宏觀的評價(jià)方法來補(bǔ)充調(diào)整現(xiàn)行的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

生物活性測定法是采用恰當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法對藥物的某種生物活性進(jìn)行評價(jià)，是一種涵蓋藥理學(xué)和藥檢統(tǒng)計(jì)分析，可定量的活性測定方法[5]。目前，美國FDA《植物藥工業(yè)開發(fā)指南》，《中國藥典》(2015版)都將生物活性評價(jià)方法納入其中[6-7]，表明以生物活性作為中草藥、植物藥的一種質(zhì)量評價(jià)模式已得到越來越多的重視和認(rèn)可，生物活性測定法用于中藥質(zhì)量控制已是一種必然的趨勢。

采用生物活性測定法建立一種反映丹參注射液有效性的新質(zhì)控方法，對其現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充，能更好的評價(jià)丹參注射液的品質(zhì)，提高相關(guān)中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展速度，加快其有效性及安全性的研究與再評價(jià)的進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日本大耳白家兔(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn))，♂，體重(2.1±0.5) kg；許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0009。

1.2 供試藥品丹參注射液由A、B、C、D四個(gè)廠家提供，其中A、B、C廠家各2批次，D廠家3批次，均為提供部頒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下檢驗(yàn)報(bào)告合格的藥品。藥品批號(hào)見Tab 1。

Tab 1 Different batches of Danshen injection sample information

1.3 儀器與試劑LBY-NJ4型半自動(dòng)血小板聚集儀(北京瀚邦生物科技有限公司)，ADVIA 2120i型血細(xì)胞分析儀(美國SIEMENS公司)，0.9%氯化鈉注射液(中國大冢制藥有限公司，批號(hào)：0B72H2)，枸櫞酸鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20101025)血小板聚集功能AA激活檢測試劑盒(北京瀚邦生物科技有限公司，批號(hào)：401034)。

1.4 血漿制備家兔采取心臟取血，加入3.2%枸櫞酸納(1 ∶ 9)抗凝?？鼓?60g，離心10 min，得到富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)，余下血液繼續(xù)2 000g，離心10 min，得貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。用血液分析儀測定PPP和PRP中的血小板個(gè)數(shù)，利用PPP稀釋調(diào)節(jié)PRP，使PRP中的血小板數(shù)在5×1011·L-1左右。為保證結(jié)果的可靠性，PPP和PRP應(yīng)在室溫條件下，不可過度震蕩，且確保在4 h內(nèi)完成血小板聚集的測定[8]。

1.5 樣品制備通過實(shí)驗(yàn)室綜合評價(jià)，將D廠家(批號(hào)：1807242)丹參注射液為標(biāo)準(zhǔn)品，向其加入0.9%的生理鹽水。以0.85的劑間比分別配制濃度為100%、85%、72.3%、61.4%、52.2%、44.4%、37.7%、32.1%、27.3%的樣品各1 mL。取其他各廠家的丹參注射液，用0.9%的生理鹽水作為溶劑，以0.85的劑間比分別配制濃度為100%、85%、72.3%、61.4%、52.2%、44.4%、37.7%、32.1%、27.3%的供試品各1 mL，備用。

1.6 血小板聚集率測定取PPP 300 μL加入一次性測試杯，校準(zhǔn)調(diào)零。取PRP 274 μL，分別加入不同濃度的樣品液10 μL，37 ℃孵育3 min，依次加入花生四烯酸(arachidonic acid,AA)16 μL，測定5 min內(nèi)的血小板最大聚集率[9]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析各樣本效價(jià)數(shù)據(jù)及方法學(xué)考察結(jié)果應(yīng)用中國藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 量效學(xué)考察結(jié)果在丹參注射液標(biāo)準(zhǔn)品(S)體外對抗血小板聚集的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)血小板聚集率隨丹參注射液濃度增加具備量效關(guān)系。注射液濃度在27.3%～100%范圍內(nèi)，量效關(guān)系顯著，可得線性方程為y=-1.21x+114.30，r2= 0.965 9。具體測定結(jié)果見Fig 1，Tab 2。丹參注射液供試品(T)量效學(xué)考察結(jié)果見Tab 3。綜合丹參注射液的量效學(xué)考察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)注射液濃度在37.7%～52.2%范圍內(nèi)，量效關(guān)系明顯，線性良好。

Fig 1 The dose-effect relationship of anti-platelet aggregation of standard Danshen injection

Tab 2 The dose-effect relationship of anti-platelet aggregation of standard Danshen injection (n=3)

根據(jù)量效關(guān)系考察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丹參注射液對AA誘導(dǎo)的血小板聚集率均隨濃度增加而成對數(shù)下降的趨勢?？刹捎蒙锘钚詼y定法中的量反應(yīng)平行線中三三法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步篩選線性范圍，各批次線性考察結(jié)果見Fig 2。由圖中結(jié)果可知，丹參注射液濃度在37.7%～52.2%范圍內(nèi)，線性較好，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，從而完成線性范圍篩選。

2.2 效價(jià)測定與可靠性，重復(fù)性考察結(jié)果

2.2.1效價(jià)測定 丹參注射液標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)按劑間比1 ∶ 0.85各配置高、中、低3個(gè)濃度，各濃度梯度均按照S1、T1、T2、S2、S3、T3的順序分別測定標(biāo)準(zhǔn)品組和供試品組三個(gè)含藥富血小板血漿的血小板最大聚集率，平行測定3次。規(guī)定以丹參注射液標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為1 000 U/L，采用中國藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000計(jì)算供試品組測得效價(jià)(PT)和可信限率(FL%)并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，結(jié)果見Tab 4。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同廠家不同批次的丹參注射液效價(jià)測定結(jié)果不同，可信限率均小于10%，檢定結(jié)果精密度良好。與丹參注射液標(biāo)準(zhǔn)品相比，其中A廠家抑制血小板聚集活性較弱，D廠家與標(biāo)準(zhǔn)品活性相當(dāng)，B和C廠家均強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)品，更加明確直觀的反映出不同廠家的丹參注射液抑制血小板聚集作用的強(qiáng)弱，直關(guān)其藥效。

2.2.2可靠性檢驗(yàn)結(jié)果 對不同批次的丹參注射液依次進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，變異來源中的回歸項(xiàng)均顯著，曲線、偏離平行和反向二次曲線(P>0.05)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明標(biāo)準(zhǔn)品(S)和供試品(T)是兩條平行直線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以通過平行線測定的相關(guān)公式計(jì)算效價(jià)和估計(jì)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)誤差。劑間P值小于0.01，差異均有顯著性，表明本次設(shè)計(jì)劑量、劑間比安排恰當(dāng)，滿足實(shí)驗(yàn)要求。證明本方法測得各批次效價(jià)可靠，可靠性通過。

2.2.3重復(fù)性考察結(jié)果 取丹參注射液(1807251)，按照2.2.1項(xiàng)下生物活性測定方法，分別配置6份標(biāo)準(zhǔn)品及供試品，重復(fù)測定六次效價(jià)，并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，結(jié)果見Tab 5。由結(jié)果可知，6次測定結(jié)果為(1 030.38±1.93) U·L-1，測得結(jié)果均通過可靠性檢驗(yàn)，可信限率(FL)平均值2.97%，小于5%，RSD%為0.137%，小于10%，說明該方法重復(fù)性較好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于丹參注射液的抗血小板聚集活性對其進(jìn)行量效學(xué)關(guān)系考察，利用量反應(yīng)平行線中三三法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及規(guī)定丹參注射液標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為1 000 U/L，從而測定其他丹參注射液供試品效價(jià)，測得效價(jià)可靠，重復(fù)性良好。該方法能夠更好的評價(jià)不同批次丹參注射液抗血小板聚集活性，衡量其藥效強(qiáng)弱，在綜合性全面評價(jià)其質(zhì)量方面具有一定參考價(jià)值。

目前，中藥生物活性測定法仍在起步階段，尤其標(biāo)準(zhǔn)品的建立尚無成熟的參考原則。該實(shí)驗(yàn)建立了丹參注射液體外抗血小板聚集活性的標(biāo)準(zhǔn)品，后期將組織不同實(shí)驗(yàn)室對其進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，可進(jìn)一步為標(biāo)準(zhǔn)品的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。

近年來，中藥注射劑因其劑量小、生物利用度高、療效快、耐藥率低等特點(diǎn)，愈加廣泛的應(yīng)用到臨床中，已成為無可替代的中藥新產(chǎn)品[10]。研究建立一種丹參注射液的新質(zhì)量評價(jià)方法，必將極大的推進(jìn)中藥注射液生物活性測定法進(jìn)步。該方法的建立能夠?yàn)樘接懮锘钚詼y定法在中藥質(zhì)量控制方面提供方法學(xué)借鑒，進(jìn)一步可為中藥標(biāo)準(zhǔn)品的建立及生物測定方法的研究開創(chuàng)新思路。

Tab 3 The dose-effect relationship of anti-platelet aggregation of Danshen injection (n=3)

-：indicate that it isn’t detected

Fig 2 The linear range of anti-platelet aggregation of Danshen injection

Tab 4 Potency of different batches of Danshen injection

Tab 5 Repetitive study on relative bioavailability potency of Danshen injection(n=6)