張 贊,黃 逯,張 慧,林 昊,莫玉煥,謝 鵬,吳超權

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021)

玉葉金花(MussaendapubescensAit.f.)，壯藥名為勾北豪，屬茜草科植物，常用其干燥根莖入藥。具有清熱、解毒、利濕、消腫的功效，主要用于感冒、咽喉疼痛、腸炎、支氣管炎、腎炎水腫等疾病[1]，廣西民間常用其莖葉熬制涼茶，同時，也是玉葉解毒顆粒、玉葉解毒糖漿、玉葉清火片、玉葉清火膠囊等成藥中的君藥。玉葉金花中含有大量的化學成分，如三萜類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類等，由于其成分較多，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用的關鍵效應成分尚不十分明確。近年來譜效學的廣泛應用，為中藥的藥效物質研究提供了有利手段，通過數學分析模型，將指紋圖譜與生物效應進行關聯，建立其質量、療效與化學成分的內在關系。本實驗考察了不同批次玉葉金花提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛藥效作用，建立了HPLC指紋圖譜，通過灰色關聯分析方法研究了其抗炎、鎮(zhèn)痛藥效與指紋圖譜之間的相關性，為完善玉葉金花藥材質量評價標準，探索其藥效物質基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器液相色譜儀LC-20A(島津公司)，電子天平CP224S (Sartorius公司)，水浴鍋DK-98-IIA 雙列8孔(天津泰斯特)，超聲波清洗器KQ-400DE(昆山市超聲儀器有限公司)，100 g手提式高速粉碎機DFT-100A(溫嶺市林大機械有限公司)，電子萬用電爐(天津市泰斯特儀器有限公司)；8 mm耳腫打孔器(上海紅太陽五金店)。

1.2 藥物與試劑玉葉金花藥材分別于不同月份采收于廣西柳州，批號分別為20170201(S1)、20170202(S2)、20170301(S3)、20170302(S4)、20170401(S5)、20170402(S6)、20170501(S7)、20170601(S8)、20180901(S9)、20180902(S10)，來自湖南三金制藥有限公司。主要試劑(批號)：山梔苷甲酯(201103)、綠原酸(201817)、8-O-乙酰山梔苷甲酯(201703)、異綠原酸A(201706)，購買自中國食品藥品檢定研究院；玉葉金花苷酸甲酯(X22D9L78554)，購買自上海源葉生物科技有限公司；新綠原酸(1850010)、異綠原酸B(S0990020)、異綠原酸C(J1010010)、隱綠原酸(L1470010)，購買自上海安譜實驗科技股份有限公司；去痛片(180306)，購買自廣東華南藥業(yè)集團有限公司；地塞米松(1704011)，購買自天津力生制藥股份有限公司；乙酸(20150302)、乙醇(20181209)購買自國藥集團；乙醚(20170103)，購買自上海沃凱生物技術有限公司；吡啶(180225)，購買自西隴科學股份有限公司；巴豆油(20160207)，購買自吉安市青原區(qū)綠源天然香料油提煉廠。

1.3 動物小鼠(昆明種，SPF級)，♂，體質量(20±2)g，由廣西食品藥品檢驗所生產(許可證號SCXK桂2017-0002)。

1.4 玉葉金花藥材提取物的制備分別取各批次藥材500 g打粉，置燒杯中，加入6倍量的50%乙醇，混勻，浸泡1 h后，超聲處理(頻率40 kHz，功率320 W)1 h，放到電爐上煎煮1 h，稍冷后，用8層紗布過濾，收集濾液，同法對藥粉再提取1次，合并2次濾液，置水浴上蒸干，加水溶解并完全轉移至100 mL容量瓶，定容至刻度，再稀釋20倍即得(溶液濃度相當于生藥量250 g·L-1)。

1.5 玉葉金花藥材提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用

1.5.1耳腫實驗[2]取144只小鼠，隨機分組，設陽性組、模型組、藥材(S1～S10)提取物組，每組12只，分別給予地塞米松(0.2 g·L-1)、純化水、藥材提取物，每天按20 mL·kg-1體積 ig 1次，d 7給藥1 h后，將巴豆油混合液0.01 mL涂在每只小鼠的左耳廓正反面，右耳不做處理。小鼠耳部致炎腫脹后 4 h，脫頸椎法處死小鼠，從耳根處剪下左、右兩邊耳片，用打孔器在所剪耳片相同處打下圓形片，稱重，計算左、右耳片重量差，即腫脹度，以模型組與各給藥組腫脹度之差占模型組腫脹度的百分比表示抑制率。

1.5.2扭體實驗[3]取小鼠144只，按2.2.1的方法分組并給藥，其中陽性組給予去痛片(36.5 g·L-1)，d 7給藥1 h后，各小鼠ip 醋酸溶液(0.6%)0.2 mL,計時15 min，記錄其扭體次數，以模型組與各給藥組小鼠扭體均數之差占模型組扭體均數的百分比表示抑制率。

1.6 玉葉金花藥材提取物指紋圖譜的測定

1.6.1對照品混合液的制備 精密稱取對照品適量，用甲醇溶解，分別將玉葉金花苷酸甲酯、綠原酸、異綠原酸(A、B、C)、新綠原酸、8-O-乙酰山梔苷甲酯、隱綠原酸、山梔苷甲酯配成20 mg·L-1的儲備液。精密吸取各儲備液1 mL，置同一容量瓶(25 mL)中，加甲醇至刻度，混勻即得。

1.6.2色譜條件 色譜柱(ZORBAX SB C18，250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，柱溫：30 ℃；流動相A為乙腈，流動相B為0.15%磷酸水溶液；進樣量：10 μL，按(0～15 min，7% A；15～75 min，19% A；75～90 min，90% A)梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1；UV檢測器：254 nm。

1.6.3指紋圖譜及共有峰的確定 分別取10批玉葉金花藥材(S1～S10)提取物和對照品混合液，按1.6.2項色譜條件進樣測定色譜圖，以峰面積篩選共有峰，以對照品色譜峰表征特征峰，用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(國家藥典委員會2004 A版)對指紋圖譜進行評價。

2 結果

2.1 小鼠耳腫脹的影響稱量耳片重量，統計結果表明，與模型組相比，玉葉金花各給藥組與陽性對照組均明顯改善巴豆油混合液致小鼠耳腫脹程度(P<0.05)，見Tab 1。

2.2 小鼠扭體的影響記錄小鼠15 min內扭體次數，統計結果表明，與模型組相比，玉葉金花各給藥組與陽性對照組均明顯抑制0.6%醋酸溶液致小鼠扭體作用(P<0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Effects of different concentrations of Mussaenda pubescens Ait.f. on acute ear swelling and twist in mice n=12)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3 玉葉金花藥材指紋圖譜

2.3.1共有峰及特征峰的確定 分析10批玉葉金花藥材提取物色譜圖并進行匹配(見Fig 1)，確定26個共有峰(見Fig 2)。以玉葉金花苷酸甲酯作為參照峰，通過保留時間確定，各對照品(色譜峰號)分別為：新綠原酸(8)、山梔苷甲酯(11)、綠原酸(12)、隱綠原酸(14)、玉葉金花苷酸甲酯(15)、8-O-乙酰山梔苷甲酯(20)、異綠原酸B(24)、異綠原酸A(25)、異綠原酸C(26)，見Fig 3。

由Fig 1～3可知，各批次玉葉金花藥材提取物的指紋圖譜與對照基本一致，表明所含成分基本相同，部分峰面積有差異，表明各批次所含成分的含量存在不同。

2.3.2相似度評價 利用軟件匹配分析，10批玉葉金花藥材提取物指紋圖譜的相似度分別為S1：0.928，S2：0.754，S3：0.926，S4：0.956，S5：0.973，S6：0.925，S7：0.946，S8：0.890，S9：0.965，S10：0.941。結果表明，除S2和S8外，其余樣品相似度在0.925～0.973，表明各批次玉葉金花藥材質量基本穩(wěn)定。

2.4 玉葉金花藥材提取物指紋圖譜與其抗炎、鎮(zhèn)痛作用相關性的分析

2.4.1抗炎作用與指紋圖譜相關性分析 采用灰色關聯度分析方法[4]，設母序列為不同批次玉葉金花藥材提取物對巴豆油混合液致小鼠耳腫脹的抑制率，子序列為HPLC指紋圖譜的26個峰面積，分辨系數ρ為0.5，經數據處理所得關聯度見Tab 2，關聯度為0.727 2～0.577 9，共有峰(編號)對抗炎作用貢獻大小順序為19>2>3>23>25>8>4>22>17>1>26>14>7>12>21>18>5>6>24>10>20>11>9>16>13>15，說明玉葉金花藥材提取物的抗炎作用是不同化學成分協同作用的結果，對抗炎作用較大的是19、2、3、23、25、8號峰，經與對照品比對，其中25號峰為異綠原酸A，8號峰為新綠原酸。

Fig 1 Fingerprint matching diagram of Mussaenda pubescens Ait.f.

Fig 2 Common peak figure

Fig 3 Mixed control solution diagram

Mixed reference: 8,Neochlorogenic acid; 11,Shanzhiside methyl ester; 12,Chlorogenic acid; 14,Cryptochlorogenic acid; 15,Mussaenoside; 20,8-O-Acetyl Shanzhiside methyl ester; 24, Isochlorogenic acid B; 25,Isochlorogenic acid A; 26, Isochlorogenic acid C.

Tab 2 Results of correlation between anti-inflammatory activity and fingerprint

2.4.2鎮(zhèn)痛作用與指紋圖譜相關性分析 采用2.4.1方法，設母序列為不同批次玉葉金花藥材提取物對醋酸致小鼠扭體作用的抑制率，子序列為HPLC指紋圖譜的26個峰面積，分辨系數ρ為0.5，經數據處理所得關聯度見Tab 3，關聯度為0.733 3～0.570 8，共有峰(編號)對鎮(zhèn)痛作用貢獻大小順序為5>11>20>4>16>17>10>7>21>3>6>22>18>9>1>14>12>13>8>19>23>2>26>24>25>15，說明玉葉金花藥材提取物的鎮(zhèn)痛作用是不同化學成分協同作用的結果。對鎮(zhèn)痛作用貢獻較大的為5、11、20、4、16、17號峰，經與對照品比對，其中11號峰為山梔苷甲酯，20號峰為8-O-乙酰山梔苷甲酯。

Tab 3 Results of correlation between analgesic activity and fingerprint

3 討論

本研究對不同批次的玉葉金花藥材進行了高效液相色譜分析，根據色譜峰面積篩選了26個色譜共有峰，并確定了9個特征峰。采用灰度關聯分析法將HPLC指紋圖譜與其抗炎鎮(zhèn)痛作用進行相關性分析，從分析結果可知，共有峰的關聯度大部分大于0.62，表明發(fā)揮藥效作用的過程中，不同化學成分很可能都參與其中。

在對抗炎作用貢獻較大的前6個色譜峰中，確定兩個特征峰為異綠原酸A和新綠原酸；在對鎮(zhèn)痛作用貢獻較大的前6個峰中，確定兩個特征峰為山梔苷甲酯和8-O-乙酰山梔苷甲酯。以上4個特征峰成分的抗炎、鎮(zhèn)痛作用均有報道，劉楊等[5]通過異綠原酸A對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠模型的干預研究表明其能明顯減輕大鼠足跖的腫脹度、降低模型大鼠的脾臟系數、明顯抑制骨關節(jié)損傷的病理改變。楊海星[6]用脂多糖刺激小鼠巨噬細胞，建立體外炎癥模型，考察金銀花中新綠原酸的抗炎作用，研究表明，200 mg·L-1濃度時，對模型細胞產生的NO和PGE2的量均有明顯抑制作用，并顯著下調iNOS和COX-2 mRNA和蛋白的表達。朱斌等[7]研究表明，獨一味鎮(zhèn)痛作用的有效成分為山梔子苷甲酯和 8-O-乙酰山梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜苷。

因此異綠原酸A、新綠原酸、山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯極大可能為玉葉金花藥材的主要抗炎鎮(zhèn)痛藥效物質，可作為其質量控制的關鍵成分，本實驗中仍有部分未知峰，其是否對藥效產生了影響有待深入研究。