王蔚倩，葉鉉玲，陳 巖，熊愛珍，楊 莉，王崢濤

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 1．中藥研究所中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2．交叉科學(xué)研究院，上海 201203)

近年來，中藥的“毒性”問題已引起國(guó)際社會(huì)的關(guān)注和擔(dān)憂，繼“馬兜鈴酸”風(fēng)波之后，另一大類毒性更強(qiáng)、波及面更廣的天然植物性毒素-吡咯里西啶生物堿(pyrrolizidine alkaloids, PAs)，成為國(guó)際上關(guān)注的新熱點(diǎn)[1]。PAs廣泛分布于6000多種高等植物中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)660余種PAs及其氮氧化物，其中近一半都被報(bào)道對(duì)人或者牲畜有毒性[2]。被PAs污染的谷物、牛奶、蜂蜜等食物及含PAs的傳統(tǒng)草藥、補(bǔ)劑、茶等均可對(duì)人類造成極大的危害。PAs可導(dǎo)致肝竇阻塞綜合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome，HSOS)、肝巨大細(xì)胞癥、肝纖維化壞死等嚴(yán)重的肝臟損傷，目前在臨床上尚無(wú)有效的預(yù)防和治療藥物。

HSOS是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(sinusoidal endothelial cells，SECs)損傷致肝竇流出道阻塞所引起的肝內(nèi)竇性門脈高壓，又稱肝小靜脈閉塞病(hepatic veno-occlusive disease，HVOD)，臨床主要癥狀為肝腫大、肝區(qū)疼痛、腹水、黃疸、高血膽紅素等[3]。其發(fā)病機(jī)制可能與SEC內(nèi)谷胱甘肽耗竭，一氧化氮消耗，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的肝內(nèi)表達(dá)增加，以及凝血因子的激活等有關(guān)[4]。HSOS缺乏特效治療，重癥患者常因多臟器功能衰竭而死亡，在發(fā)病早期及時(shí)識(shí)別以及早期干預(yù)至關(guān)重要[5]。SEC鋪襯在肝血竇內(nèi)，表面富含窗孔，為肝竇和竇周間隙(Disse間隙)之間溶質(zhì)的交換開放通道，可以通過改變窗孔直徑和數(shù)量調(diào)節(jié)肝血竇內(nèi)外的物質(zhì)交換與信息交流，參與形成血液—肝細(xì)胞屏障[6]。由于SEC是HSOS的最直接損傷部位，所以近年來相關(guān)機(jī)制研究開始關(guān)注肝竇內(nèi)皮的損傷，并以此作為研究切入點(diǎn)。

野百合堿(monocrotaline，MCT)主要存在于豬屎豆屬植物中，是目前研究最多的毒性PAs之一，常用來在動(dòng)物上建立HSOS模型[7]。MCT進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)被肝臟中的細(xì)胞色素P450酶代謝活化為脫氫野百合堿(dehydromonocrotaline，DMCT)，并迅速與細(xì)胞大分子如蛋白質(zhì)作用形成吡咯蛋白加合物(pyrrole-protein adducts，PPA)，繼而引發(fā)肝毒性。有研究表明，DMCT與內(nèi)皮細(xì)胞上的F-actin共價(jià)結(jié)合后，可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解體和內(nèi)皮細(xì)胞的圓形化甚至脫落，并伴隨著血紅細(xì)胞進(jìn)入竇周間隙，同時(shí)導(dǎo)致MMPs的升高，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)，由此進(jìn)一步造成SEC脫落[8-9]。SEC脫落死亡是HSOS發(fā)病過程中至關(guān)重要的因素，也是HSOS區(qū)別于其他類型肝損傷的顯著特征。

目前關(guān)于PAs對(duì)SEC毒性的報(bào)道研究大都利用整體動(dòng)物模型，影響因素較多，而幾乎沒有將PAs直接作用于人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(human hepatic sinusoidal endothelial cells，HHSECs)上進(jìn)行體外毒性機(jī)制的深入研究。本研究以MCT為代表性藥物，研究其體外直接作用于HHSEC的毒性反應(yīng)及其作用機(jī)制，為臨床HSOS的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑HHSEC細(xì)胞株與其特制培養(yǎng)體系(MED-0002)購(gòu)于中國(guó)武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司；人正常肝細(xì)胞株(L-02)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)2122752)購(gòu)于美國(guó)Life Technology 公司；胎牛血清(批號(hào)1739463)及青霉素-鏈霉素(批號(hào)2068824)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；MCT(BP0957)購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司； RIPA裂解液(批號(hào)TL277222)和BCA 蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)UB276926)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；抗體cleaved caspase-3(#9661)、PARP(#9532)、β-actin(#4970)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司；還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號(hào)20180821)購(gòu)于南京建成生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)AI70509A)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(批號(hào)AJ10745A)購(gòu)于日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒(批號(hào)PG678)購(gòu)于日本同仁公司；Caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AFC(批號(hào)2857919)購(gòu)于美國(guó)Biomol公司；Hoechst染色試劑盒(批號(hào)022519190919)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA極速抽提試劑盒(#220011)購(gòu)于上海飛捷生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)；SparkTM多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；ABSCIEX QTRAP6500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)ABSCIEX公司)；凝膠電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；凝膠成像儀(美國(guó)GE 公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；QuantStudio 6 Flex 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems 公司)。

2 方法

2.1 藥物配制稱取適量MCT，用10%的鹽酸水溶液充分渦旋溶解，加1 mmol·L-1NaOH 調(diào)節(jié)至pH 7.2，配制母液500 mmol·L-1。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HHSEC培養(yǎng)于含5%滅活胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑和1%青霉素-鏈霉素的人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特制培養(yǎng)基。人正常肝L-02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞放置在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)CCK-8試劑盒被用于檢測(cè)細(xì)胞活性。將HHSEC接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分別與不同濃度的MCT，共孵育24 h后棄去原培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中分別加入100 μL含10% CCK-8培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(450 nm)。將細(xì)胞存活率以對(duì)照組的百分比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力/%=(給藥組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)×100%。

2.4 PPA含量測(cè)定參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法，采用柱前衍生化LC-MS法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)基中PPA的含量[10]。采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞蛋白裂解液及培養(yǎng)基分別使用Ehrlich試劑反應(yīng)衍生化處理，再利用液質(zhì)連用儀進(jìn)行檢測(cè)。以Waters Acquity BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)色譜柱分離，0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫，梯度洗脫如下：0～1 min，10% B；1～6 min，40% B；6～10 min，95% B。流速為0.4 mL·min-1，進(jìn)樣2 μL。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM(341>252；341>296)測(cè)定樣本中PPA的含量。

2.5 細(xì)胞內(nèi)GSH含量測(cè)定將細(xì)胞與不同濃度的MCT共孵育24 h，收集細(xì)胞，參照GSH試劑盒說明書測(cè)定GSH含量。

2.6 Hoechst 33258細(xì)胞染色觀察將HHSEC接種于96孔板(2×104個(gè)/孔)，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的MCT，共孵育24 h后棄去培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書，加入固定液固定10 min，PBS洗滌兩遍后加入Hoechst 33258染色液染色5 min，再用PBS洗滌兩遍，在熒光顯微鏡下觀察。

2.7 Caspase-3酶活性檢測(cè)使用caspase-3熒光底物(Ac-DEVD-AFC)測(cè)定caspase-3活性。將細(xì)胞與不同濃度的MCT共孵育24 h，收集細(xì)胞，提取蛋白，用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。參照試劑盒說明書，取20 μg蛋白，加20 μmol·L-1熒光底物及緩沖液至200 μL于96孔板中，混勻后在37 ℃恒溫箱中避光孵育1 h，測(cè)定熒光信號(hào)。熒光信號(hào)通過熒光酶標(biāo)儀分別在400 nm和510 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)。根據(jù)給藥組與空白對(duì)照組吸光值的比值計(jì)算相對(duì)caspase-3活性。

2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)將細(xì)胞與不同濃度的MCT共孵育24 h，收集細(xì)胞，提取蛋白，用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白變性，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(上樣量為每孔30 μg蛋白)，然后電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜。先用5% BSA室溫封閉2 h，再與一抗(1 ∶ 1 000)4 ℃共孵育過夜，用PBST洗去殘留的一抗后與相應(yīng)二抗(1 ∶ 5 000)孵育1 h，再用PBST洗去多余抗體，最后將膜放于顯影液中反應(yīng)，置凝膠成像儀中觀察。以內(nèi)參蛋白 β-actin為參照，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析將細(xì)胞與不同濃度的MCT共孵育24 h，收集細(xì)胞，根據(jù)RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒說明書提取總RNA，用PrimeScript RT Master Mix試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書使用SYBR green預(yù)混物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)細(xì)胞中目的基因mRNA 表達(dá)水平。以內(nèi)參基因GAPDH為參照，通過2-ΔΔCt方法分析目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。使用的引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers for qPCR analysis

3 結(jié)果

3.1 MCT對(duì)HHSEC細(xì)胞存活率的影響HHSEC與不同濃度MCT(0、0.5、1、5、10 mmol·L-1)共孵育24 h，通過CCK-8試劑盒檢測(cè)MCT對(duì)HHSEC細(xì)胞存活率的影響。由Fig 1A可知，與空白組比較，5 mmol·L-1MCT能顯著降低HHSEC的細(xì)胞存活率至72%，10 mmol·L-1MCT則將細(xì)胞存活率明顯降低為45%。然而，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，MCT(0～10 mmol·L-1)對(duì)L-02細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響(Fig 1B)。由此可知，HHSEC對(duì)MCT的毒性更加敏感。

3.2 細(xì)胞及培養(yǎng)基中PPA的含量測(cè)定HHSEC與不同濃度MCT(0、1、5 mmol·L-1)共孵育24 h后，檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)基中PPA的含量。由Fig 2可知，給藥后HHSEC細(xì)胞及培養(yǎng)基中都檢測(cè)到一定含量的PPA，且細(xì)胞及培養(yǎng)基中PPA含量均隨MCT給藥濃度增加而增多。

Fig 1 Cytotoxicity of MCT on HHSECs and L-02

*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol·L-1MCT

Fig 2 Concentration of PPA in cell lysate and medium of HHSECs exposed to

*P<0.05,**P<0.01vs1 mmol·L-1MCT.

3.3 MCT降低了HHSEC內(nèi)GSH的含量HHSEC與不同濃度MCT(0、1、5 mmol·L-1)共孵育24 h后，HHSEC細(xì)胞內(nèi)的GSH含量隨MCT給藥濃度的增加而減少。如Fig 3所示，5 mmol·L-1MCT給藥24 h可顯著降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量(P<0.05)。

3.4 MCT誘導(dǎo)HHSEC發(fā)生凋亡HHSEC與不同濃度MCT(0、5、10 mmol·L-1)共孵育24 h后，通過Hochest染色，caspase-3活性，cleaved caspase-3及cleaved parp的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡。由Hoechst33258染色結(jié)果可知(Fig 4A)，5和10 mmol·

Fig 3 GSH content in HHSECs decreased by

*P<0.05vs0 mmol·L-1MCT

L-1MCT給藥組可見明顯細(xì)胞核固縮, 提示MCT可誘導(dǎo)HHSEC發(fā)生凋亡。5和10 mmol·L-1MCT給藥組caspase-3蛋白酶活性顯著升高，分別為空白對(duì)照組的3.0倍和17.8(Fig 4B)。由Fig 4C可知， MCT(10 mmol·L-1)給藥還可顯著增加HHSEC細(xì)胞凋亡活化蛋白標(biāo)志物cleaved caspase-3及cleaved parp的蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果均表明，MCT可誘導(dǎo)HHSEC凋亡。

3.5 相關(guān)基因的表達(dá)水平檢測(cè)HHSEC與不同濃度MCT(0、1、5 mmol·L-1)共孵育24 h后，收集細(xì)胞并檢測(cè)了相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果可知(Fig 5)，相比空白對(duì)照組，5 mmol·L-1MCT給藥組CYP3A4基因表達(dá)水平升高3.9倍，VEGFA和MMP-9表達(dá)水平分別增加1.9倍和3.1倍，而NOS3表達(dá)水平則顯著下降，約為空白對(duì)照組的54%。

4 討論

PAs是導(dǎo)致臨床HSOS的主要原因之一[3]。近年來，因誤服誤用含PAs的中草藥及復(fù)方所致HSOS的報(bào)道逐年增多，引起了國(guó)際國(guó)內(nèi)社會(huì)的廣泛關(guān)注。目前，關(guān)于HSOS的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，涉及多種細(xì)胞、分子以及信號(hào)通路。大量研究表明，SEC損傷是HSOS發(fā)生的起始因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4,15]，然而由于SEC細(xì)胞上代謝酶含量相對(duì)較低，幾乎沒有將PAs直接作用于SEC的體外研究，大多數(shù)研究者采用體內(nèi)動(dòng)物模型，使得其機(jī)制更加復(fù)雜。因此，本研究嘗試以HHSEC模型研究MCT的體外毒性作用，并初步探討其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制。

Fig 4 Apoptosis in HHSECs induced by

A:Representative images of Hoechst staining of HHSECs. White arrows denote apoptotic nuclei. The bar represents 25 μm;B:Caspase-3 activity assay of total cell lysates of HHSEC;C:The protein expression levels of cleaved caspase-3 and cleaved parp.*P<0.05,**P<0.01vs0 mmol·L-1MCT

Fig 5 The mRNA expression levels of target genes in

**P<0.01vs0 mmol·L-1MCT

我們首先測(cè)試了MCT對(duì)HHSEC 的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明MCT(5, 10 mmol·L-1)可顯著降低HHSEC的細(xì)胞存活率，而同樣濃度下MCT對(duì)L-02細(xì)胞則沒有明顯毒性，由此證明了MCT對(duì)HHSEC毒性的特異性。大部分PAs需過肝臟細(xì)胞色素P450酶(主要為CYP3A4酶)代謝活化并生成PPA繼而引發(fā)肝臟毒性。PPA不僅是PAs代謝活化的直接證據(jù)，也被中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)肝膽疾病協(xié)作組建議作為PAs毒性生物標(biāo)記物[3]。我們?cè)诮o藥MCT的HHSEC細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)基中均檢測(cè)到了大量PPA，且其含量與MCT給藥濃度且呈劑量依賴性增加。由此可知，MCT經(jīng)HHSEC中的藥物代謝酶代謝活化后形成活性中間體，一方面與細(xì)胞中的蛋白結(jié)合形成PPA，另一方面也可排出細(xì)胞與培養(yǎng)基中的蛋白結(jié)合形成PPA。這與文獻(xiàn)在PAs所致HSOS的臨床患者及灌胃PAs的動(dòng)物血液及肝組織檢測(cè)到PPA的報(bào)道相符[10]。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了HHSEC細(xì)胞代謝酶的水平，在HHSEC中檢測(cè)到了一定含量的代謝活化關(guān)鍵酶CYP3A4，而MCT可以誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)，進(jìn)一步加速M(fèi)CT代謝活化，從而加劇對(duì)HHSEC的損傷。

谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑和自由基清除劑，對(duì)于細(xì)胞生理功能的維持具有重要作用。研究表明，PAs經(jīng)代謝活化產(chǎn)生的活性中間體，除了與蛋白結(jié)合生成PPA進(jìn)一步誘發(fā)毒性外，還可通過與GSH結(jié)合生成GSH結(jié)合物從而利于其排出而解毒[11]，這也是體內(nèi)PAs毒性的一條重要的減毒途徑。而HHSEC由于自身所含GSH水平較低，GSH大量消耗且無(wú)法及時(shí)補(bǔ)充，將使其更加易于受到毒物的侵害而死亡，從而加劇了HSOS損害[8]。與本實(shí)驗(yàn)中，MCT給藥后HHSEC中GSH含量顯著下降，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，也是造成其毒性的重要原因之一。

此外，細(xì)胞凋亡也被認(rèn)為是PAs引發(fā)毒性的重要機(jī)制之一[12-14]。caspases蛋白家族在細(xì)胞凋亡過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。caspase-3蛋白是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，在藥物或其他信號(hào)分子作用下，caspase-3被剪切活化產(chǎn)生cleaved caspase-3，并剪切其下游靶蛋白PARP產(chǎn)生cleaved parp，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因此，cleaved caspase-3及cleaved parp可用作凋亡的指標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)中，MCT給藥可誘導(dǎo)HHSEC細(xì)胞核固縮、深染，誘導(dǎo)caspase-3酶活力呈劑量依賴性增加，并誘導(dǎo)細(xì)胞中cleaved caspase-3及cleaved parp的蛋白表達(dá)水平升高。由此可知，MCT可誘導(dǎo)HHSEC發(fā)生凋亡，導(dǎo)致毒性。根據(jù)課題組前期的研究及文獻(xiàn)報(bào)道，PAs可在體內(nèi)外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致毒性，但其中涉及到多種信號(hào)分子及作用機(jī)制，包括降解抗凋亡因子Bcl-xl[12]、誘導(dǎo)Drp1干擾線粒體分裂融合[13]、誘導(dǎo)Fas受體[14]等。然而，MCT誘導(dǎo)HHSEC凋亡具體通過哪些信號(hào)通路仍需進(jìn)一步深入研究。

另有研究表明，MCT可引起大鼠竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞中F-actin的解聚，導(dǎo)致SEC中金屬蛋白酶-9(MMP9)表達(dá)增加，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)造成SEC脫落誘導(dǎo)HSOS[15]。而Iguchi等[16]則觀察到HSOS患者血清VEGF水平顯著升高。我們的研究表明，MCT顯著增加了HHSEC細(xì)胞中MMP-9和VEGFA的mRNA表達(dá)水平，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。另外我們還發(fā)現(xiàn)MCT可降低HHSEC中NOS3的mRNA表達(dá)水平。內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)是一種心血管系統(tǒng)中的重要酶，表達(dá)于SEC，可催化一氧化氮(NO)的生成，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[17]；在HSOS模型動(dòng)物中，可見NO含量顯著下降[18]。我們的研究表明，MCT降低了NOS3的mRNA表達(dá)水平，這可能會(huì)減少NO的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞加劇毒性。

綜上所述，MCT 經(jīng)HHSEC內(nèi)代謝酶代謝活化，同時(shí)消耗細(xì)胞內(nèi)GSH破壞肝臟抗氧化系統(tǒng)。MCT代謝活化一方面激活了HHSEC凋亡，另一方面影響內(nèi)皮及血管系統(tǒng)等進(jìn)一步加劇HHSEC損傷。本研究探討了MCT對(duì)HHSEC的體外細(xì)胞毒性及其毒性機(jī)制，為PAs所致臨床HSOS疾病的研究提供了理論依據(jù)。